猪圆环病毒Ⅰ型实时荧光 PCR 检测试剂盒使用说明.PDF

猪圆环病毒Ⅰ型实时荧光PCR 检测试剂盒使用说明书 用途 本试剂盒采用实时荧光PCR 方法检测猪血清和组织中的猪圆环病毒I 型的DNA ，适用于PCV-1 的检测、诊断和流行病学调查。 原理 利用离心柱内惰性大分子膜提取病料DNA 作为模板，以引物为起点合成与DNA 模板，在热启 动Taq 酶的作用下，经高温变性、中温退火及延伸的循环，使特异DNA 片段的拷贝数放大一倍，经 荧光素标记的探针与扩增的DNA 杂交，利用Taq 聚合酶的5→3外切活性，使荧光探针的报告基团 与淬灭基团分离，发出特异性荧光信号，利用荧光PCR 仪检测特异性荧光信号，根据样品Ct 值的 大小及扩增曲线的形成情况判定结果。 试剂 1. 试剂盒组成 名称 50 头份 贮藏条件 DNA 吸附柱和收集管 50 套 消化液 11mL DNA 结合液 16mL 室温（A 盒） DNA 洗涤液 52mL DNA 洗脱液 4 mL 蛋白酶K 1.1mL 阴性对照 1 mL PCV-1 阳性对照 600 μL -20 ℃（B 盒） 无菌无核酸酶水 600 μL PCR 反应液 750 μL 引物 110 μL 荧光探针 65 μL 2. 试剂盒保存期：6 个月。 需要自备的器材 1．仪器：分析天平、水浴锅、离心机、荧光PCR 扩增仪、组织研磨器、-20 ℃冰箱、可调移液器（2 μL、20 μL 、200 μL、1000 μL）。 2 ．耗材：荧光PCR 专用反应管、眼科剪、眼科镊、生理盐水、1.5 mL 灭菌离心管、吸头（10 μL、 200 μL 、1000 μL）、灭菌双蒸水。 使用注意事项 1．所有接触病料的物品均应合理处理，以免污染实验室。 2 ．PCR 整个试验分配液区、模板提取区、扩增区、电泳区。流程顺序为配液区 模板提取区 扩 增区。严禁器材和试剂倒流。 3 ．所有试剂应在规定的温度储存，-20℃保存的塑料袋内各试剂管使用前应放于室温完全融化，使用 后立即放回-20 ℃。 4 ．消化液低温时可能出现结晶，请于37 ℃温育，溶解至澄清透明后使用。 5 ．注意防止试剂盒组分受污染。使用前将各试剂管8000 rpm 离心15 s，使液体全部沉于管底，放 于冰盒中，吸取液体时移液器吸头尽量在液体表面层吸取。 6 ．不要使用超过有效期限的试剂，试剂盒之间的成分不要混用。 7 ．反应体系应在特定配液区或者超净工作台中配制，整个实验过程严格控制污染。 技术咨询电话：010820 联系人：孙明 乔明明 E-mail：pcr@ 8．严格遵守操作说明可以获得最好的结果。操作过程中移液、定时等全部过程必须精确。 9 ．反复冻融试剂将减低检测灵敏度，建议在3 次内用完，请严格按试剂盒说明书操作。 样品制备 1 样品采集：病死或扑杀的猪，取肺、淋巴结等组织；待检活猪，用注射器取血5 mL 。2～8 ℃保存， 送实验室检测。（要求送检病料新鲜，严禁反复冻融病料。） 2 样品处理：每份样品分别处理。 2.1 组织样品处理：每份组织分别从三个不同的位置称取样品约1g，用手术剪剪碎混匀后取0.05 g 于研磨器中研磨，加入1.5 mL 生理盐水继续研磨，待匀浆