六基因的重组与转移.ppt

脂质体有商业试剂盒（如Life Technologies）。 2. 脂质体（lipofectin）载体法 脂类包埋DNA，通过细胞膜进入细胞。 直接把外源DNA注射到宿主细胞核里，使其整合到染色体上。 3. 显微注射法(microinjection) 雄原核 雌原核 二乙氨乙基（diethyl-aminoehtyl，DEAE）葡聚糖能促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。 4. DEAE---葡萄糖转染法 葡聚糖 葡聚糖+DNA 吸附到细胞表面后被细胞吞入，部分DNA可以进入到细胞核里。 DEAE-葡聚糖 细胞 外源DNA 预处理 摄入 DEAE-葡聚糖 外源DNA 细胞 混合 DEAE-葡聚糖对细胞有毒! 5. 病毒（virus）介导 腺病毒反、转录病毒等 部分外源基因导入细胞的方法 转化 基因枪法 显微注射法 病毒介导 3. 插入基因的开放阅读框（ORF）正确 （1）DNA定向插入 （2）起始密码 尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。 ATGGAATTC 载体 ATGCGGAATTCT 插入片段 EcoRI EcoRI ATGGAATTC T 重组 但移码突变！ 4. 防止载体自身环化连接 （1）提高插入片段的用量 连接反应体系中，插入片段比载体多10倍以上。 （2）用碱性磷酸酶处理载体 载体切口的5’磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片段以单链连接。 5’ 3’ 载体 插入片段 1. 载体自身环化连接（能存活） 2. 载体之间互相连接（能存活） 3. 插入片段互相连接（不能存活） 4. 一个载体与几个插入片段重组（能存活） 五、载体和外源DNA插入片段的连接结果 5. 几个载体与一个插入片段重组（能存活） 17 1. 目的 增加受体菌细胞膜的通透性。 第二节 重组体导入细菌细胞 一、感受态大肠杆菌的制备 使用丧失了限制体系的大肠杆菌。如K12系列的大肠杆菌。 2. 菌种 用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。 3. 制备原理 4. 制备过程 培养大肠杆菌 OD600至0.3-0.4 On ice 5-10 min 4℃离心收集菌 用冰冷的60mMCaCl2重悬 4℃离心收集菌 4℃离心收集菌 分装、-70 ℃冻存（15%甘油） 用冰冷的60mMCaCl2重悬 On ice 30 min 用冰冷的60mMCaCl2重悬 二、重组DNA导入大肠杆菌 （1）转化（transformation) 大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。 （2）转染（transfection) 大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。 1. 外源DNA导入细菌的几种方法 （3）转导（transduction) 借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。 每?gDNA转化成功的细菌克隆数。 3. 转化方法 2. 转化率 简单，但转化效率不高（106-108/?gDNA）。 （1）热休克法（heat shock） 转化效率高（高于109/?gDNA）。 （2）电转化法 10ng载体DNA 100?L感受态菌 On ice混合，静置10分钟 42oC 1分钟 加入1mL LB培养基 37℃摇1小时 10-100?L转化液涂含抗菌素的平板 吸附DNA 摄入DNA （1）热休克法 LB培养受体菌至OD600=0.5-0.6 冰浴15分钟，2 ℃离心集菌 冰冷的水重悬菌体 2 ℃离心集菌 冰冷的水重悬菌体 2 ℃离心收集菌体 少量冰冷的水重悬 分装成 50-300?L 电转仪调为2.5kV 脉冲控制器200-400? 0.5?g质粒DNA On ice混合 加入1mL培养液 37℃中速震荡60分钟 10-100?L转化液涂含抗菌素的平板 转化 （2）电转化法 4. 平板培养基培养细菌 10-100?L转化液 涂于含抗菌素的平板 37℃过夜 环形重组质粒 质粒自我连接 线性载体或DNA片段进入细菌会被降解。 环形质粒数 （1）重组质粒 5. 影响转化率的因素 ①生长状态 制备感受态菌必须使用对数生长期的菌。 ②必须在冰冷的条件下制备。 要充分，使细菌细胞膜失去一些蛋白。 ④储存感受态菌要在-70℃以下 ③CaCl2处理 ⑤使用感受态菌时必须梯度融化 融化后一般不能再次冻存使用。 （2）感受态细胞 （competent cells) 把重组的噬菌体?DNA或Cosmid质粒DNA包装成具有感染能力的?噬菌体颗粒。 6. 体外包装的噬菌体的转导 （1）体外包装（in vitro packaging） （2）转导（transduction） 通过受体菌细胞表面的?DNA接受器位点（receptor site)，使带有外源基因的重组体DNA注入受体大肠杆菌进行扩增。 cI857基因是个温度敏感性阻遏蛋白基因，感染细菌后，在32℃下培养