基因工程载体人工染色体载体.ppt

第三节 其他载体 2012.09 其他载体 一、人工染色体 二、植物基因工程载体 三、动物基因工程载体 一、人工染色体 二、植物载体 Plant cloning vectors Ti质粒:侵染广泛的双子叶植物 T-DNA或T-区(T-region)：约20kb，包含专化冠瘿碱生化合成和冠瘿瘤生长的基因，随机地整合到植物染色体上。 结构特点：两端具有25个碱基对的顺向重复序列，但重复不是完全的。25个碱基对的序列称为T-DNA的边界序列(T-DNA border sequence)。去除右边界序列，将使T-DNA失去转移和整合的功能；左边界的缺失，对致瘤性无明显影响。 毒性区域即vir(virulence)区域:引起T-DNA转移的区域。长度约35kb，和T-DNA处于不同位置 植物Ti质粒载体 T-DNA区域内的所有基因与转移无关，所以将致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed)后，将细菌抗生素的抗性基因或其它序列插入到这个区域，形成的T-DNA仍可将RB至LB内的序列转移并整合到植物基因组。 Vir区的毒性基因是T-DNA转移所必需的，毒性基因可以顺式及反式两种方式控制T-DNA转移。 2、Ti质粒载体 Disarmed Ti vectors（非致瘤载体） Cointegrate vectors（共整合载体） Binary vectors（双元载体） 1） Disarmed Ti vectors 去除T-DNA中的肿瘤基因 在T-DNA中插入用于转化植株筛选的遗传标记基因 Intermediate vectors A small portion of T-DNA was subcloned in a conventional E.coli plasmid vector (i.e. pBR322) for easy manipulation, producing intermediate vectors Intermediate vectors are incapable of replication in A.tumefaciens and also lack conjugation functions. Transfer of them was achieved using a triparental mating. Triparental mating An E.coli strain A carrying a helper plasmid able to mobilize the intermediate vector in trans The E.coli strain B carrying the recombinant intermediate vector A.tumefaciens carrying the disarmed Ti plasmid 3. Binary vector T-DNA does not need to be physically attached to the rest of the Ti plasmid Use separate plasmids to supply the disarmed T-DNA and the virulence functions Ti质粒及其衍生载体 Ti质粒是约200-500kb的环状DNA分子，很难直接使用，故需对其加以改造，构建出Ti质粒的衍生载体系统，广泛用作植物基因工程中的载体： （1）双元载体(binary vectors） 如pBin19载体，具有原核生物的卡那霉素抗性基因(AphⅠ)作为细菌选择标记，真核生物的卡那霉素抗性基因(nos-NptⅡ)作为植物的选择标记，pUC19的多克隆位点及α-互补显色标记 （2）共整合载体(integrated vectors) CaMV克隆载体 含1个约8kb的环状双链DNA分子； 用于十字花科和少数非十字花科的植物基因转移； 其感染对植物有害，不能直接做载体； CaMV的DNA在植物细胞中能高水平转录35S RNA，其启动子是一强启动子。构建的含35S启动子的系列克隆载体可在植物细胞内高效表达基因。 三、动物载体 Cloning vectors of animal cell 动物病毒：猿猴病毒-40(SV-40)的衍生物 5243 bp共价闭合环状分子 感染率高，几乎100％寄主细胞能被感染 能提供完整的真核基因转录所需的成分  侵染性具有寄主特异性 改建：野生型最多只能包装其基因组长度的1.05倍的 DNA分子 其他：痘苗病毒DNA作载体，表达乙肝表面抗原 用家蚕的核多角体病毒表达人α-