显微成像方法与技术.pptx

（十）激光扫描共聚焦显微境 激光扫描共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope，LSCM）在荧光显微镜成像基础上加装激光扫描装置，利用计算机进行图像处理，使用紫外或可见光激发荧光探针，从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像，在亚细胞水平上观察Ca2+、pH值、膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中强有力的研究工具。 随着计算机、光学显微镜、大数值孔径物镜、高分辨率分析显示、激光源、激光功率、高敏感度探测器、声光转换电子控制和各种荧光标记物的发展，使得LSCM向更精、更快、多维和无损伤性分析的方向发展。 传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射光或散射光的干扰；激光扫描共聚焦显微镜利用激光扫描束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面上的每一点扫描，标本上的被照射点在探测针孔处成像，由探测针孔后的光电倍增管（PMT，photoelectric multiplier tube）或冷电荷耦合器件（cCCD，cooled charge-coupled device）逐点或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服了普通显微镜图像模糊的缺点。 在显微镜的载物台上加一个微量步进马达，可使载物台上下步进移动，这样细胞或组织各个横断面的图像都能清楚地显示，实现了“光学切片”的目的。 激光扫描共聚焦显微镜的基本原理 从激光器出来的激发光被主二色分光镜（分色镜）反射并被显微镜物镜聚焦到样品上。焦点处的激发强度最大，但整个光锥内的荧光染料都被激发了，无论是焦平面上部还是焦平面下部的染料分子都发射出荧光。从样品返回的光被物镜收集并聚焦到一个微小的光阑即针孔上。针孔所在的平面是样品焦点所在的平面的共轭面（即共焦），只有从样品焦点处出来的光才能通过针孔并被针孔后的光电倍增管（PMT）探测到。从焦平面之上或下发出的光就被针孔有效的阻挡了。因此，焦点的图像极大的排除了散射光的干扰。通过精确控制的振镜使聚焦激光逐点扫描样品，从而获得样品某一光学切面的图像。 共聚焦的原理 荧光显微镜与激光共聚焦显微镜的区别 激光共聚焦扫描显微镜的特点 1. 可对样品进行非侵入性无损断层扫描，即“光切片”（optical sectioning），最薄可达0.28微米； 2. 可三维重建，重现立体图像，还可在不同的观察方向对不同深度层次的样品成象； 3. 排除焦点外模糊，成象更加清晰，改善水平分辨率，可达0.10-0.14微米。 激光扫描共聚焦显微镜的设计特点 1.点照明； 2.具有照明pinhole和探测pinhole； 3.照明pinhole和探测pinhole共轭(共焦), 共焦点即被探测点，被探测点所在的平面为共焦平面； 4.具有扫描系统——逐点扫描成像； 5.具有多个荧光通道，可同时探测多个被标记物的荧光。 BIO-RAD MRC600 LSCM系统扫描头结构示意图 MRC600 LSCM系统中使用BHS或GHS滤光块时光路的特点 激光光源 氩离子激光器（Ar+） ：458nm（CFP）；488nm（FITC、GFP、Fluo-3）； 514nm（罗丹明123、TEXAS红、YFP、Fluo-3） 氦-镉激光器（He-Cd）：442nm（丫啶橙、荧光素、福尔根-希夫试剂）；325nm（Hoeschst、DAPI） 氦-氖激光器（He-Ne）：633nm（叶绿素、MitoTracker Doeep Red、DsRed） 氦-氖激光器（He-Ne）：543nm（DsRed） 氪离子激光器（Kr+）：紫外—可见区，647nm（叶绿素） 倍频氖激光器（YAG）：532nm 激光光源的特点 1) 方向性好：激光器发射的激光光束的发散度极小，大约只有0.001弧度，接近平行。1962年，人类第一次使用激光照射月球，地球离月球的距离约38万公里，但激光在月球表面的光斑不到两公里。 2) 单色性好：激光器输出的光，波长分布范围非常窄（??=10-8nm）。以输出红光的氦氖激光器为例，其光的波长分布范围可以窄到2×10-9nm，是氪灯发射的红光波长分布范围的万分之二。 3) 高亮度：在激光发明前，人工光源中高压脉冲氙灯的亮度最高，而红宝石激光器的激光亮度，能超过氙灯的几百亿倍。因为激光的亮度极高，所以能够照亮远距离的物体。激光亮度极高的主要原因是定向发光。大量光子集中在一个极小的空间范围内射出，能量密度自然极高。 4) 偏振性:激光的频率、振动方向