人类疾病动物模型概述(2016级研究生,2016年9月)精要.ppt

FEMALE MALE +/+ -/- +/+ -/- 3. HSF1基因敲除 Xiao XZ, et al. EMBO J, 18(21): 5943-52.1999 条件性基因敲除（conditional gene knockout) 条件性基因敲除主要通过Cre/loxP或者Ftp/FRT重组系统来实现。 Cre/loxP系统 Cre/loxP系统来源于F1噬菌体，可以介导位点特异的DNA重组。该系统含有两种成分：①一段长34bp的DNA序列，含有两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列，称为loxP位点；②Cre重组酶，它是一种由343个氨基酸组成的单体蛋白，可以引发loxP位点的DNA重组。当一段DNA序列位于两个loxP位点之间的时候，在Cre重组酶的作用下，这段序列可被删除(当两个loxP位点的方向相同)，或者方向发生倒转(当两个loxP位点的方向相反)。 利用Cre/loxP系统进行条件性基因敲除，需要两只转基因小鼠。第一只小鼠通过同源重组技术将loxP位点分别置于目的基因的两端；第二只是转基因小鼠，将Cre重组酶置于某特定基因启动子的调控之下，可以使其在某特定组织或诱导物存在的条件下表达。最后，让这两只小鼠进行交配，所产生的同时含有上述两种基因型的子代小鼠就会在某一特定类型的组织细胞或在诱导物作用下缺失某特定基因。 Cre/loxP系统的作用机制 3、基因敲入动物（gene knockin animal) 即通过同源重组技术将外源基因定点整合到宿主基因组中，且拷贝数确定，解决了传统转基因动物制备中随机整合、拷贝数不定的缺陷。 4、基因敲低动物(gene knock-down animal) 即表达RNAi的转基因动物。通过随机或定点敲入的方式将某种siRNA基因整合至基因组，利用RNAi机制调低动物中某种基因的表达水平。与基因敲除动物相比，制备更为简单、快速、经济。 5、基因修饰技术新进展（ZFN, TALENs, CRISPR/Cas9) 经典方法 ： 经典的基因敲除技术： 由细胞自身进行随机双链断裂和同源重组，发生几率低(~1/106 cells），再靠正负筛选来获得同源重组细胞。 基因修饰新技术： 采用特异的DNA识别域 + 核酸酶，在特定的DNA位点切断DNA，形成双链断裂，大大改善了同源重组的效率，实现对基因组进行更加精确、有效的改造。 实现染色体DNA序列的人工编辑修改 点突变：Silent，Missense，Nonsense，Frame shift（基因敲除） 片段删除 片段插入 目的与用途：疾病模型制备、基因功能研究、基因治疗等 基因修饰新技术解决传统的挑战 （1）ZFN 技术 锌指核酸酶（Zinc-finger nucleases, ZFN）是人工改造的限制性核酸内切酶，利用不同的锌指结构识别特异DNA序列，利用核酸酶切断靶DNA。 锌指结构中的两个半胱氨酸可与另两个半胱氨酸（C）或组氨酸（H）一起与锌离子络合而形成指状结构，每一个指状结构可特异识别3-4个碱基； 人工设计识别特异DNA序列的锌指结构采用如上的通用序列，通过改变其中7个X来实现识别不同的三联体碱基，TGEK是多个螺旋间的连接序列； 构建成对人工锌指结构域和FokI融合蛋白（ZFN）可以在指定区域切断DNA双链。 锌指核酸酶介导的定向染色体删除 研究人员可以利用ZFN技术进行各种基因编辑，比如基因敲除。已建立有ZFN库，识别多种DNA序列，但还不能达到识别任意靶DNA的目的，其应用受到一定的限制。 （2）TALEN技术 概念：转录激活子样效应子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALENs)。最初在植物病原体黄单胞菌属中发现，即某些多肽能特异性结合到宿主基因的某个位点从而激活该宿主基因的表达 。与ZFNs相比，TALENs 的DNA识别序列更长，故脱靶效应的几率较小，现已应用于细胞、酵母、斑马鱼、大鼠、小鼠等各类研究对象。 技术原理： 表达一个重组核酸酶，在靶点识别结构域的作用下，核酸酶发挥内切酶活性，从而打断目标基因，完成基因敲除的过程。 1989年 植物病原体黄单胞菌属 （Xanthomonas spp.） avrBs3 基因被克隆。 2007年 发现其具有序列特异性核酸结合特性， avrBs3 – TA 2009年 Xanthomonas TA氨基酸序列与核酸靶序列的对应关系被破译 由34个aa组成一个单元模块，重复14 -18次