目的基因的连接与转化.ppt

目的基因的连接、转化 分类及原理 分类： 根据限制性内切酶酶切后产生的末端的类型，分为非互补突出末端的连接、相同粘性末端的连接、平末端连接 常用碱性磷酸酶 本实验连接材料及连接体系 连接示意图 连接体系 1. 载体和插入片段的摩尔浓度比载体：插入片段的摩尔数的变化范围可为8：1到1：16，但通常的变化范围是3：1到1：3。插入片段的长度和序列的变化会影响和同一载体的连接效果。每一个连接反应都需要作实验，来选择最佳的载体和插入片段的摩尔数比。在最小的反应体积中，通常一个连接反应用10-50ng的载体DNA。 2. 进行连接反应时的保温的时间和温度也需优化。一般而言，平末端连接在22℃保温4-16小时，粘性末端在22℃保温3小时，或16℃保温16小时。大多数连接反应用T4DNA连接酶，但大肠杆菌的DNA连接酶可用于粘性末端的连接，平末端连接时用此酶，活力较低。 3. 载体和插入片段的纯度应较高，融解的溶剂最好使用灭菌的双蒸水而不是TE，毕竟TE中含有离子，可能影响连接反应。 感受态细胞的制备 Hanahan法是制备高效感受态细菌的标准方法。 这种化学方法制备的感受态细菌的转化效率可达到109 cfu/μg DNA。 注：1.低温培养，18℃培养至OD600约为0.5； 2.超净台无菌操作，低温操作； 3.标准质粒的种类不同同种感受态的转化率不同，不同质粒形态转化率也不相同。 转化原理 1. 0℃的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态； 2. 加入DNA，Ca2+又与DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶（DNase）的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上； 3. 经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA分子便趁机进入细胞内。Mg2+的存在对DNA的稳定性起很大的作用，MgCl2与CaCl2又对大肠杆菌某些菌株感受态细胞的建立具有独特的协同效应。二甲基亚砜（DMSO）和二巯基苏糖醇（DTT）进一步诱导细胞产生高频感受态的程序，大大提高了大肠杆菌的转化效率。 转化示意图 连接效率的计算 * * DNA连接示意图 载体自连及去磷酸化 分子量 100,000 温度 37 ℃ 最适PH10.0附近（高底物浓度）PH 8.0附近（低底物浓度） 65℃30分钟处理99％的活性不可逆失活，随具体条件改变有变动，完全失活苯酚处理 分子量 80,000 温度 60 ℃ —65℃ 最适PH8.0 热稳定性好，100 ℃暂时性失活，室温放置可恢复活性，苯酚完全失活 CIAP(小牛肠) BAP（大肠杆菌） 用蒸馏水稀释至6ul 载体DNA 17 ng 目的DNA 50 ng 连接缓冲液（5×） 1.2 ul 附注：目的DNA的总体积是3ul，如果不够总质量以总体积为准 连接效率= 转化子数 载体质量 (个/ ng) 转化效率 × × (个/ ng) 100%