细菌基因重组及遗传分析.ppt

中断杂交实验作图 （1）不同的非选择标记进入受体且重组的时间不同，但都是稳定的； （2）各基因的重组频率随着时间的增加而增加，直至极值； （3）按时间顺序，先重组和后重组的基因，重组率的极值在逐步减少； 该方法主要根据基因转移的先后次序，以时间为单位，求基因间的遗传距离。 1957年Wollman和Jacob首次进行中断杂交实验： 供体菌：HfrH strs thr+ leu+ azis tons lac+ gal+ 受体菌： F- strr thr? leu- azir tonr lac- gal- 将大约10倍的F-菌与 Hfr对数期菌混合，轻轻振荡培养 在不同时间间隔取样，然后在组织搅拌中剧烈振荡 振荡后的培养物涂布于加了链霉素的基本培养基上 筛选不同于两个亲本的thr+ leu+ strr重组子 再对每一个重组子的非选择性标记azi ton lac gal 进行测定。 azi：叠氮化钠抗性， ton：噬菌体T1抗性 1分钟≈20%的重组值 五、BAC人工染色体 为什么会想到把F质粒改造成载体？ 自然发生的F因子能携带1/4的大肠杆菌染色体而不显张力或不稳定。 拷贝数低: 1 有助于减少DNA 分子间重组 保证文库转化子生长平衡 减小对受体菌的毒副作用 Bacterial Artificial Chromosome 1992年Shizuya等以F质粒为基础构建的具有大容量克隆能力的载体--- BAC 。 3.插入基因 第二节 接合作用（conjugation） 接合作用：是指细菌通过细胞间的接触而导致遗传物质的转移和基因重组的过程，又称细菌杂交。介导接合作用的质粒叫做接合质粒（conjugative plasmid），也叫自主转移质粒（self-transmissible plasmid）或性质粒（sex plasmid）。 接合作用的特征： 接合作用中需要供体和受体细胞间的直接接触---G-通过性质粒编码的性菌毛介导，G+由受体细胞分泌类似于性激素的短肽刺激细胞接合； G-细菌中的接合质粒一般分子量较大，有几十个tra基因参与转移， G+细菌中的接合质粒较小，只有几个tra基因参与转移； 无论G-或G+菌，接合质粒除自身能从供体向受体转移外，还能带动供体染色体向受体转移。 一、接合现象的发现与证实 Lederberg和Tatum（ 1946年）建立了用大肠杆菌K12的两个营养缺陷型菌株在基本培养基上是否生长，来检验细菌杂交或重组存在的方法。在此以前，没有人证实细菌杂交现象。细菌杂交有别于典型的有性杂交，故称为细菌接合作用。 A菌株 B菌株 混合培养后在基本培养基中出现的原养型菌落是否是杂交的结果？ 必须要排除下列几种解释： 一是细菌细胞并没有接合，而是交换了DNA(转化作用) 二是细胞并未接合，而是通过培养基交换了养料(互养) 三是细菌细胞并未接合而是亲本发生了回复突变 当时Lederberg和Tatum已经证明，当把A菌株的培养液经过灭菌，再加入到B菌株的培养液中，没有原养型菌落，这说明上述实验并非转化的结果。 1950年，Davis通过他的U形管试验进一步支持了Lederberg和Tatum的结论。 1.转化作用的排除 Davis把这两种缺陷型菌株A和B分别注入底部用烧结玻璃滤板隔开的U形管的两臂中 滤板只允许培养基和大分子物质通过，细菌不能透过 培养一定时间后，从两端分别取样、离心、洗涤，再涂布于基本培养基平板上，结果未发现有原养型菌落出现 结果表明混合培养时得到的重组子不是转化的结果，同时也证明重组子的出现需要两亲本细胞的直接接触 营养缺陷型细胞通过培养基交换养料而生长的现象亦称为互养。 2.互养的排除 在A- B+ T1s和A+ B- T1r的杂交中，将基因型A- B+ T1s和A+ B- T1r两种细菌在基本培养基上混合培养，接触较短的一段时间以后，喷上噬菌体T1，把A- B+ T1s细菌杀死。 经培养以后仍有原养型菌落出现，这说明原养型菌落的出现并非由于互养。 因为大肠杆菌的突变率一般都10-8，若两个基因同时回复突变，则其可能性只有10-16（10-8×10-8），这种几率在平板上是很难检测到的，所以混合培养能出现10-5~10-6频率的菌落一定是重组的结果。 3.回复突变的排除 4.遗传物质的单向转移 两种细菌只有接触才能产生重组子，这种重组子产生的过程是怎样的呢？ 最初人们设想：细菌重组也可能像真核生物一样伴随在减数分裂或某种染色体分离之后的核融合，形成完全的接合子，而且两个亲本在接合过程中都起了同样的作用。 Hayse利用Lederberg和Tatum所做的杂交试验： Hayse（1952）用正反杂交实验证