现代生物技术实验.doc

一、DNA粗提取和鉴定 一、实验目的 1.初步掌握DNA的粗提取和鉴定的方法。 2.观察提取出来的DNA物质。 二、实验原理 1.DNA与蛋白质分离　根据二者的特性,即在浓度较高的氯化钠溶液(物质的量浓度为2?moL/L?)中,核蛋白容易解聚,游离出DNA。而DNA在浓度较高的氯化钠溶液中的溶解度很高,Na+与带负电的DNA结合成DNA钠盐。这时DNA在溶液中呈溶解状态。 2.DNA的析出与获取利用 DNA在浓度较低的氯化钠溶液中溶解度小的原理,向含有DNA的浓度较高的氯化钠溶液中加入大量(300?mL?)蒸馏水,稀释氯化钠溶液,使DNA的溶解度下降,而蛋白质的溶解度增高(这就是蛋白质的盐溶现象),从而使二者分离。 3.DNA的沉淀和浓缩　酒精沉淀法。就是将含有Na+的DNA溶液,加入到相当于其两倍体积的体积分数为95%冷酒精溶液中,混匀以后可以使DNA沉淀、浓缩,形成含杂质较少的DNA丝状物,悬浮于溶液中。如果出现的丝状物较少,可以将此混合液再放入冰箱中冷却几分。浓缩后的DNA丝状物,可以用缓缓旋转玻璃棒的方法卷起(因为玻璃棒有吸附DNA的作用)。 5.DNA的鉴定　本实验中鉴定DNA的方法为二苯胺法(配方见下述的“药品配制”)。二苯胺法的原理是:DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成ω-羟基-γ酮基戊醛,它再和二苯胺作用而显现蓝色(溶液呈浅蓝色)。 鉴定时溶液蓝色的深浅,与溶液中DNA含量的多少有关。 附：二苯胺试剂的配制 A液：　15?g二苯胺溶于100?mL?冰醋酸中,再加15?mL浓硫酸,用棕色瓶保存。如冰醋酸呈结晶状态,则需加温后待其熔化,再使用。 B液：　乙醛的体积分数为0.2%的溶液。 配制：　将0.1?mL?B液加入到10?mL?A液中,现配现用。 三、实验方法 1.材料用具 新鲜菜花(菠菜)。 塑料烧杯,量筒,玻璃棒,尼龙纱布,陶瓷研钵,试管,试管架,试管夹,漏斗,酒精灯,石棉网,三角架,火柴,刀片,天平,研磨液,体积分数为95%的酒精溶液,二苯胺试剂,蒸馏水。 2.方法步骤 (1)DNA的粗提取 　　①准备材料　将新鲜菜花和体积分数为95%的酒精溶液放入冰箱冷冻室,至少24?h。 　　②取材　称取30?g菜花,去梗取花,切碎。 　　③研磨　将碎菜花放入研钵中,倒入10?mL研磨液,充分研磨10?min?。 　　④过滤　在漏斗中垫上尼龙纱布,将菜花研磨液滤入烧杯中(有条件的学校可将滤液倒入塑料离心管中进行离心,用1?000r/min的旋转频率,离心25?min,取上清液放入烧杯中)。在4?℃冰箱中放置几分后,再取上清液。 　　⑤加冷酒精　将一倍体积的上清液倒入两倍体积的体积分数为95%的冷酒精溶液中,并用玻璃棒缓缓地轻轻搅拌溶液(玻璃棒不要直插烧杯底部)。沉淀35?min后,可见白色的DNA絮状物出现。用玻璃棒缓缓旋转,絮状物会缠在玻璃棒上。 (2)DNA的鉴定 　　①配制二苯胺试剂　取0.1?mL?B液,滴入到10?mL?A液中,混匀。 　　②鉴定　取4?mL?DNA提取液放入试管中,加入4?mL?二苯胺试剂,混匀后观察溶液颜色(不变蓝)。用沸水浴(100?℃)加热10?min?。在加热过程中,随时注意试管中溶液颜色的变化(逐渐出现浅蓝色)。 附：研磨液的配制方法  Tris：10.1?g(相对分子质量为121.14),先加50?mL?蒸馏水溶解,用物质的量浓度为2?moL/L?的盐酸调至pH8.0,再加下述药品。 　　NaCl：8.76?g(相对分子质量58.44) 　　EDTA：37.2?g(相对分子质量372.24) 　　SDS：20?g(相对分子质量288.3) 待上述药品全部溶解后,再用蒸馏水定容至1?000?mL。 若在室温低于20?℃时配制药液,SDS呈沉淀析出,此时需要加温,才能将SDS溶解。如果提前配制的研磨液出现了沉淀,则应加温使沉淀溶解后再使用。 附：研磨液中几种药品的作用  SDS(十二烷基磺酸钠):可使蛋白质变性,与DNA分离。 ????? EDTA(乙二胺四乙酸二钠):为DNA酶的抑制剂,可以防止细胞破碎后DNA酶降解DNA。 　　物质的量浓度为0.15?moL/L的氯化钠溶液：能很好地溶解DNA。 　　Tris/HCl：提供缓冲体系,DNA在这个缓冲体系中呈稳定状态。(Tris为三羟甲基氨基甲烷) 二、红叶石楠的组织培养快 任务1、培养基的配制 一、目的（一）熟练掌握配制MS工作培养基的基本技能（二）掌握母液移取、培养基的熬制与分装、扎口技术与灭菌方法二、原理????配制工作培养基时，按照标准配方和终体积，依次量取各种母液于容量瓶（或烧杯