第五章固定化酶讲述.ppt

琼脂-陶瓷双介质包埋：用于细胞固定，琼脂是细菌最适培养基 ,有利于保持菌体生物的活性，而陶瓷粒则能增加固定化细胞的强度。 有机聚合物涂缚在无机载体上，兼具了两者的优点 3．? 定向固定化技术 把酶和载体在酶的特定位点上连接起来 ，使酶在载体表面按一定的方向排列，使它的活性位点面朝固体表面的外侧排列，有利于底物进入到酶的活性位点，酶的活力和固定量都有显著提高。 4．多种固定化方法联用 采取吸附 -交联法、包埋-交联法，细胞凝聚-交联法、包埋-共价结合法、二次包埋法等提高固定化产物的多方面的性能。 包埋 -交联法：先用明胶包埋 ,再用戊二醛交联，稳定性有极大提高。 吸附-交联法：离子交换树脂吸附后再用多功能基化合物交联，可提高固定化酶的活性及稳定性，机械性能也较好。 二次包埋法：聚丙烯酰胺凝胶交联过程中放热及单体和交联剂自身的毒性造成细胞及酶的失活现象，先用琼脂包埋细胞 ,再用 PAM包埋的二次固定法。 5．多酶联合固定化技术 充分利用其各自特点 ，把不同来源的酶和整个细胞的生物催化性能结合一起。 辅酶再生 苹果酸脱氢酶(MDH)、乳酸脱氢酶(LDH)和柠檬酸缩和酶(CS)组成的NAD+—NADH再生偶联酶系统； 乙酸激酶(AK)、谷胱甘肽合成酶(GSHS)组成的ADP—ATP再生偶联酶系统。 α-淀粉酶与糖化酶的共固定化实现了淀粉的液化与糖化两步反应的合二为一、淀粉一步水解为葡萄糖，且操作半衰期可达92 0h，而当α-淀粉酶、糖化酶及葡萄糖异构酶共固定化时又可使淀粉转化果糖。 采用甲酸脱氢酶 （FDH）甲醛脱氢酶 （FADH）和乙醇脱氢酶 （ADH)三种脱氢酶包埋共固定，酶法转化ＣＯ2 为甲醇。 二、新型载体材料及技术 1．价廉宜得的天然高分子材料 纤维素及其衍生物 ?? 壳聚糖及其衍生物 家蚕丝纤维： 储量丰富的自然资源，对蛋白质具有较高的亲合性，易改性，制备简易,安全无毒和具较好的生物相容性。 2．特殊功能的新型载体 ① 无孔微球载体： 微小的体积, 提高了酶的结合效率；并消除了底物和产物的扩散阻力。 ②??新型的多孔型或大孔性载体： 能够使固化酶的通透性得以改善。 ④磁性高分子微球： 内部含有磁性金属或金属氧化物的超细粉末而具有磁响应性的高分子微球。 利用外部磁场可以控制固定化酶的运动方式和方向,替代传统的机械搅拌方式;有利于从反应体系中分离和回收，操作简便 。 ③ 温敏性水凝胶载体： 随温度改变溶解状态，可实现均相催化和异相分离的统一。 以Ｎ-异丙基丙烯酰胺与丙烯酰胺及其衍生物共聚得到温敏性水凝胶载体 酸敏性载体：肠溶衣聚合物：pH4.0，不可溶，pH5.0，可溶。 ⑤载体加臂：有利于减少空间阻碍而提高载酶量及固定化酶活性，。 以不同链长的二元胺活化聚丙烯酸甲酯及聚氯乙烯大孔球状载体时，固定化酶的活力则随活化侧基的链长增加而提高。 重点： 1.五种固定化方法及其各自特点 2.固定化酶的性质及其影响因素 3.评价固定化酶的指标 关注： 固定化技术的改进 2．分配效应和扩散限制效应 分配效应：是由于固定化载体所带电荷及的亲、疏水性、使酶的底物、产物以及其他效应物在微观环境与宏观体系间发生了不等分配，改变了酶反应系统的组成平衡，从而影响酶反应速度的一种因素。 扩散限制效应：指底物、产物以及其他效应物的迁移和运转速度受到限制的一种效应。 外扩散限制：指上述物质从宏观体系穿过包围在固定化酶颗粒周围的近乎停滞的液膜层(Nernst层)到颗粒表面所受的限制。 内扩散限制：指上述物质从颗粒表面到颗粒内部酶所在位点所受到的限制。 第二节评价固定化酶(细胞)的指标 一、固定化酶(细胞)的活力 固定化酶(细胞)催化某一特定化学反应的能力。 活力单位：定义为每毫克干重固定化酶(细胞)每分钟转化底物(或生产产物)的量，表示为μmol·min-1·mg-1。 如是酶膜、酶管、酶板，则以单位面积的反应初速度来表示．即μmol·min-1·cm-2。 二、偶联率：载体结合酶量（或酶活）的百分数 ? ? 三、活力回收和相对活力 活力回收：固定化酶活力占溶液酶活力的百分数 相对活力：固定化酶活力与同量蛋白量的溶液酶活力的比值 四、固定化酶（细胞）的半衰期 t1/2 ：固定化酶（细胞）的活力下降为最初活力1/2所经历的连续工作时间；衡量操作稳定性的指标。 Fig. 2.? Kinetic of ROL adsorption on the silica aerogels. The activity