第三章沉淀案例分析.ppt

主要内容 第一节 蛋白质表面特性 第二节 蛋白质沉淀方法 第一节 蛋白质表面特性 第二节 蛋白质沉淀的方法 盐析沉淀法 等电点沉淀法 有机溶剂沉淀法 非离子型聚合物沉淀法 聚电解质沉淀法 多价金属离子沉淀法 亲和沉淀法 盐析沉淀法：蛋白质在高离子强度溶液中溶解度降低，发生沉淀的现象。 常用的盐析剂是硫酸铵，因为它的盐析能力强，在水中的溶解度大，价格便宜，浓度高时也不会引起蛋白质活性丧失。 盐析沉淀的蛋白质仍保持天然构象，即仍有活性。 蛋白质用盐析方法沉淀分离后，还需要脱盐才能进一步精提纯。脱盐常用透析法。 2 等电点沉淀 利用蛋白质在pH等于其等电点的溶液中溶解度下降的原理进行沉淀分级的方法称为等电点沉淀法。 不同的蛋白质有不同的等电点，因此通过调节溶液pH到目的蛋白的等电点，可使之沉淀而与其它蛋白质分开，从而除去大量杂蛋白。 3 有机溶剂沉淀法 有机溶剂沉淀：向含有目标物质的溶液中加入水溶性的有机溶剂(如丙酮，乙醇等)，而使目标物质发生沉淀的方法。 4 非离子型聚合物沉淀法 非离子型聚合物：利用一些非离子型的高聚物来沉淀蛋白质的方法。 5 聚电解质沉淀法 聚电解质沉淀法：利用一些含有重复离子化基团的水溶性聚合物来沉淀蛋白质的方法 6 多价金属离子沉淀法 多价金属离子：向蛋白质溶液中加入一些高价金属离子而使蛋白质沉淀下来。 7 亲和沉淀法 亲和沉淀是利用蛋白质与特定的生物的或合成的分子（免疫配位体、基质、辅酶等）之间高度专一的相互作用而设计出来的一种特殊选择性的分离技术。 沉淀原理不是依据蛋白质溶解度的差异，而是依据“吸附”有特殊蛋白质的聚合物的溶解度的大小。 作 业 1 简述蛋白质的沉淀方法。 2 什么是盐析，影响盐析的因素有哪些？ * 蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成的荷电区、亲水区和疏水区构成。 蛋白质的水溶液呈胶体性质，在蛋造白质分子周围存在与蛋白质分子紧密或疏松结合的水化层。是蛋白质形成稳定的胶体溶液、防止蛋白质凝聚沉淀的屏障之一。 蛋白质沉淀的另一屏障是蛋白质分子间的静电排斥作用。当双电层的电位足够大时，静电排斥作用抵御分子间的相互吸引作用，使蛋白质溶液处于稳定状态。 1.盐析法 中性盐：硫酸铵、硫酸钠、柠檬酸钠等 盐析沉淀原理: 由于加入大量的中性盐破坏了蛋白质的水化膜、中和其所带的电荷从而使蛋白质分子聚集而沉淀析出。 lgS=β-Ksμ 蛋白质的盐析行为常用Cohn经验式表示： 式中S为蛋白质的溶解度； μ为离子强度； β为常数，与盐的种类无关，但与温度和pH有关； Ks为盐析常数，与盐的种类有关，但与温度和pH无关。 Ks分级盐析法：在一定的pH和温度条件下，改变盐的浓度(即离子强度)达到沉淀的目的。 β分级盐析法：在一定的离子强度条件下，改变溶液的pH和温度达到沉淀的目的。 影响盐析的因素 (1)无机盐种类：离子半径小，带电多，电荷密度高的阴离子，盐析效果好。 (2)pH值：pH影响Cohn方程中的?值，pH值接近蛋白质pI值时，蛋白质溶解度最小。 (3)温度：T影响Cohn方程中的?值。温度升高，?降低；温度降低 ，?升高。 不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极性基团的种类、数目以及排布的不同，其水化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不一样，因此调节蛋白质的中盐浓度，可以使不同的蛋白质分别沉淀。如： 血清 球蛋白 清蛋白 (NH4)2SO4 50%饱和度 饱和 析出 析出 分段盐析 透析是将含有小分子杂质的蛋白质溶液装在半透膜（玻璃纸、火绵纸等）制的透析袋里放在缓冲液中进行，可不断更换缓冲液，直至杂质被除去。 透析——只用于除盐类和小分子杂质 透析——只用于除盐类和小分子杂质 超滤——除小分子杂质，分离、浓缩蛋白质 加压 蛋白质溶液 半透膜 支持膜的栅板 超滤液 沉淀原理：蛋白质在其等电点时溶解度最低。 沉淀原理： A 有机溶剂能破坏溶质分子的水化层，降低溶质的溶解度； B 有机溶剂降低水溶液的介电常数，使溶质分子间的静电引力（库仑力）增大，导致溶质的凝集和沉淀。 沉淀原理：可能有降低蛋白质分子表面的水化程度或空间排阻作用 沉淀原理：与絮凝类似，在蛋白质间起架桥作用，同时还兼有盐析、降低水化程度和电荷中和等作用。 沉淀原理：金属离子可与蛋白质分子上的某些残基发生作用而使蛋白质沉淀。 亲和过程提供了一个从复杂混合物中分离提取单一产品的有效方法。 ①初始阶段，将一个目标蛋白质与键合在可溶性载体上的亲合配位体络和形成沉淀； ②所得沉淀物用一种适当的缓冲溶液进行洗涤，洗去可能存在的杂质； ③用一种适当的试剂将目标蛋白质从配位体现中离解出来。 * * * *