免疫标记技术案例分析.ppt

免疫标记技术 免疫标记技术 免疫标记技术指用荧光素、放射性同位素、酶、铁蛋白、胶体金及化学(或生物)发光剂等作为追踪物，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应；并藉助于荧光显微镜，射线测量仪，酶标检测仪，电子显微镜和发光免疫测定仪等精密仪器，对实验结果直接镜检观察或进行自动化测定。 免疫标记技术可以在细胞、亚细胞、超微结构及分子水平上，对抗原抗体反应进行定性和定位研究；或应用各种液相和固相免疫分析方法，对体液中的半抗原、抗原或抗体进行定性和定量测定。因此，免疫标记技术在敏感性、特异性、精确性及应用范围等方面远远超过一般免疫血清学方法。 常用的几种免疫标记技术 免疫荧光标记技术 放射免疫标记技术 酶标记技术 胶体金标记技术 生物素和亲和素标记技术 发光免疫标记技术 免疫荧光标记技术 基本原理： 免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合。以荧光素作为标记物，与已知的抗体(或抗原)结合、但不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原。在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其存在部位。在实际工作中，由于用荧光素标记抗体检查抗原的方法较为常用，所以一般通称为荧光抗体技术。 荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后，即刻引起发光；停止能量供给，发光亦瞬即停止。 荧光素是一种能吸收激发光的光能产生荧光，并能作为染料使用的有机化合物。目前用于标记抗体的荧光素主要有异硫氰酸荧光黄(FITC)、四乙基罗丹明及四甲基异硫氰酸罗丹明。 荧光效率　　荧光分子不会将全部吸收的光能都转变成荧光，总或多或少地以其他形式释放。荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光光量子的数值成正比。　　荧光效率＝发射荧光的光量分子数（荧光强度）／吸收光的光量子数（激发光强度）　　发射荧光的光量子数亦即荧光强度，除受激发光强度影响外，也与激发光的波长有关。各个荧光分子有其特定的吸收光谱和发射光谱（荧光光谱），即在某一特定波长处有最大吸收峰和最大发射峰。选择激发光波长量接近于荧光分子的最大吸收峰波长，且测定光波量接近于最大发射光波峰时，得到的荧光强度也最大。 荧光抗体染色方法 ： A.直接法：这是荧光抗体技术最简单和基本的方法。滴加荧光抗体于待检标本片上，经反应和洗涤后在荧光显微镜下观察。标本中如有相应抗原存在，即与荧光抗体特异结合，在镜下可见有荧光的抗原抗体复合物。此法的优点是简单、特异。但其缺点是检查每种抗原均需制备相应的特异性荧光抗体，且敏感性低于间接法 B.间接法：用荧光素标记二抗。检测过程分为两步：第一次，将待测一抗加在含有已知抗原的标本片上作用一定时间，洗去未结合的抗体。第二，滴加标记二抗。如果第一步中的抗原抗体已发生结合，此时加入的标记二抗就和已固定在抗原上的一抗结合，形成抗原-抗体-标记抗抗体复合物，并显示特异荧光。此法的优点是敏感性高于直接法，且无需制备每一种荧光素标记的特异抗体，就可用于检测同种动物的多种抗原抗体系统。间接法的缺点是有时易产生非特异性荧光。 放射免疫标记技术 基本原理： 放射免疫标记技术是将同位素分析的高灵敏度与抗原抗体反应的特异性相结合，以放射性同位素作为示踪物的标记免疫测定方法。 由于放射免疫标记技术具有灵敏度高(可检测出毫微克(ng)至微微克(pg)，甚至毫微微克(fg)的超微量物质，特异性强(可分辨结构类似的抗原)、重复性强、样品及试剂用量少测定方法易规范化和自动化等多个优点。因此、在医学及其他生物学科的研究领域和临床实验诊断中广泛应用于各种微量蛋白质、激素、小分子药物及肿瘤标志物等的分析与定量测定。缺点是试剂使用期限短，存在放射性污染 。目前常用的同位素是125I  A.放射免疫测定(Radio immunoassay，RIA)标记抗原和未标记抗原对有限量抗体的竞争性结合或竞争性抑制反应。 B.免疫放射测定 (IRMA)待测抗原与过量标记抗体的非竞争综合反应。 C.放射受体分析(RRA)与免疫放射测定相似。应用放射性同位素标记配体，在一定条件下与相应受体结合成配体-受体复合物。 酶免疫标记技术 免疫酶技术就是将抗原和抗体的免疫反应和酶的催化反应相结合而建立的一种新技术。酶与抗体或抗原结合后，既不改变抗体成抗原的免疫学反应的特异性，也不影响酶本身的酶学活性，即在相应而合适的作用底物参与下，使基质水解而呈色，或使供氢体由无色的还原型变为有色的氧化型。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜和电子显微镜观察，也可以用分光光度计加以测定。这是一种特异而敏感的技术，可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。 常用的酶及其底物