兰州大学生化第3章氨基酸案例分析.ppt

台州学院生命科学与医药化工学院 柯世省 氨基酸的两性解离性质及等电点（pI） 对于R基有解离基团的氨基酸：pI等于等电形式两侧的pK值之和的一半，以等电形式为中心，另一个pK值为第二级解离，可以忽略不计。 如Glu：Glu+（2.19）→Glu±（4.25） → Glu-（9.67） → Glu2- 若pH=pI=3.22，根据pH = pKa+log{[质子受体]/[质子供体]} 3.22=9.67+log{[Glu2-]/[Glu-]} 得[Glu2-]/[Glu-]=3.5×10-7。 四、氨基酸的甲醛滴定 滴定终点由12左右降到9左右，可以用酚酞为指示剂，用标准氢氧化钠滴定。 氨基酸的离子交换分离原理： 若pI?pH0，两性离子带净正电荷，若pI?pH0，两性离子带净负电荷，差值越大，所带的净电荷越多。 氨基酸的分离 构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(220nm)均有光吸收。 在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。 酪氨酸的?max＝275nm，?275=1.4x103; 苯丙氨酸的?max＝257nm，?257=2.0x102; 色氨酸的?max＝280nm，?280=5.6x103; （二）氨基酸的光谱性质 蛋白质最大紫外吸收峰在280nm处。 六、氨基酸混合物的分析分离 （一）分配层析法的一般原理 层析系统 固定相（静相） 流动相（动相） 混合物在层折系统中的分离决定于该混合物的组分在这两相中的分配情况，一般用分配系数来描述。 Kd=CA/CB 层析系统中的静相可以是固相、液相或固—液混合相(半液体)；动相可以是液相或气相，它充满于静相的空隙中。并能流过静相。 有效分配系数： Keff是Rv的函数，溶质的有效分配系数可以调整两相的体积比而加以改变。 利用层析法分离混合物例如氨基酸混合物，其先决条件是各种氨基酸成分的分配系数要有差异，哪怕是很小的差异。一般差异越大，越容易分开。 目前在分析分离上使用较广的分配层析法，包括柱层析、纸层析和薄层层析等都是在分配分离的基础上发展起来的。 （二）分配柱层析 层析柱中的填充物或称支持剂都是一些具有亲水性的不溶物质，如纤维索、淀粉、硅胶等：支持剂吸附着一层不会流动的结合水，可以看作为固定相，沿固定相流动的与它不互溶的溶剂(如苯酚、正丁醇等)是流动相。 （三）（滤）纸层析 滤纸层析也是分配层析的一种。滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的溶剂是流动相。层析时，混合氨基酸在这两相中不断分配，使它们分布在滤纸的不同位置上。 四、氨基酸的化学性质 （一）α－氨基参加的反应 1.与亚硝酸的反应 氨基酸的α-氨基定量地与亚硝酸作用产生羟酸和N2，所生成的N2可用气体分析仪器加以测定，这是Van Slyke氏氨基氮测定法的原理。 2.与甲醛的反应 氨基酸两性离子的NH3+是弱酸，其pKa为9.7左右，完全离解时溶液的pH约为10±，超出酸碱滴定指示剂的显色范围，不能用一般指示剂，例如酚酞，作酸碱滴定。但当氨基酸的氨基与中性甲醛结合成氨基酸二羟甲基衍生物后，其氨基的碱性即大大减少，反应向右进行，两性离子中NH3+基的离解度增加，释出H+质子，NH3+的pKa值降低到6.5左右，溶液的pH降至6.7左右，此时NH3+离解释出的H+即可以酚酞作指示剂用标准NaOH溶液加以滴定。每释出的一个H+就相当于一个氨基酸。甲醛滴定可用来测定蛋白质的水解程度。 当氨基酸溶液中存在1mol/L甲醛时，滴定终点由pHl2左右移至9附近，亦即酚酞指示剂的变色区域。这就是甲醛滴定法的基础。 3.酰基化和烃基化反应 氨基酸氨基的一个H可被酰基或烃基(包括环烃及其衍生物)取代，这些取代基对氨基酸的氨基有保护作用。 （生物体内）在酶和ATP存在条件下，羧酸也可与氨基酸的氨基作用，形成酰基化产物。 苯甲酸与Gly的氨基的酰基化反应是生物体内解毒作用的一个典型的例子。 苯甲酸是食品防腐剂，在生物体内转变成N-苯甲酰-Gly后，可经尿排出。 α-氨基中的氮是一个亲核中心，能发生亲核取代反应。 强亲电的有机物能与α-NH2发生烷基化反应。 第一次大战中使用的芥子气，它的主要作用是使氨基酸的α-氨基烷基化，从而破坏蛋白质的正常功能。 Sanger反应 二硝基苯基氨基酸（DNP-氨基酸），黄色，层析法鉴定，被Sanger用来测定多肽的NH2末端氨基酸。 Edman反应 PTH-氨基酸，无色，可以用层析法分离鉴定。被Edman用来鉴定多肽的NH2末端氨基酸。 4.形成西佛碱反应 氨基酸的α氨基与醛类反应，生成西佛碱。 西佛碱是以氨基酸为底物的某些酶促反应例如转氨基反应的中间物。 5.脱氨基化学 氨基