WB操作步骤答案.doc

Western Blotting试验步骤 组织蛋白提取 准备组织细胞裂解液：1000ul RIPA+10ul PMSF, 装于1.5mlEP管中，充分混合。 注：如发现RIPA有沉淀，放室温半小时或常温水域使其溶解，若PMSF为粉剂，将其配置成100 mM液体备用。 组织准备：将组织从-80℃冰箱取出，放入1.5mlEP管，用小剪刀将组织建成碎片，用研磨杵研磨/玻璃匀浆器5ml匀浆充分。加RIPA裂解液（按每20mg组织加裂解液150-200微升的量添加），研磨/匀浆5分钟（在冰浴下研磨/匀浆），冰上静止30分钟。 注：1）若用玻璃匀浆器可先加3/2的裂解液，匀充分，倒到EP管，再加剩下的裂解液，把匀浆器壁上的匀浆液充分倒出来。 将裂解后的样品10000-14000g离心3-5分钟，取上清，分装至200ulEP管（一般有约400ul的上清？）即可进行PAGE、Western和免疫印迹等操作。 提取液中总蛋白的测定 用BCA法测定，试剂盒：索莱宝BCA蛋白浓度测定试剂盒。 配工作液：根据标准品和样品数量，按50体积BCA试剂加1体积Cu试剂（50:1）配制成BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内温度。 注：BCA工作液每个孔要加入200ul，标准曲线8个孔， 稀释标准品（BSA）：取10微升BSA标准品用PBS稀释至100微升（样品一般可用PBS稀释），使终浓度为0.5mg/ml。将标准品按0,2,4,6,8,12,16,20微升加到96孔板的蛋白标准品孔中，加PBS补足至20ul。 稀释样品：最好多做几个梯度，如做2倍，4倍，8倍稀释），加稀释好的样品20微升到96孔板的样品孔中。由于移液器在取小量时的误差，标准线前面的点可能不很准确，所以尽可能让样品点落在标准线1/2以后。 在各孔中加入200微升的BCA工作液，37℃放置15-30分钟。用酶标仪测定A562nm， 根据标准曲线计算出蛋白浓度。使用温箱孵育时，应注意防止因水分蒸发影响检测结果。 注：1）标准曲线布板：（单位：微升） 试剂/孔编号 1 2 3 4 5 6 7 8 标准品 0 2 4 6 8 12 16 20 PBS 20 18 16 14 12 8 4 0 工作液 200 200 200 200 200 200 200 200 样品蛋白布板： 试剂/编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 2倍稀释 4倍稀释 10倍稀释 样品 9 9 9 4 4 4 2 2 2 PBS 11 11 11 16 16 16 18 18 18 工作液 200 200 200 200 200 200 200 200 200 空白对照布板： 试剂/编号 1 2 3 4 5 6 7 8 PBS 20 20 20 20 20 20 20 20 工作液 200 200 200 200 200 200 200 200 注：测蛋白浓度过程中，可将剩下的蛋白样品存放于4℃。待浓度测完，可拿一部分蛋白样品分装，5×SDS缓冲液，于沸水中煮5-10min使蛋白变性（也可以使用PCR仪进行变性，99℃，3-5min）。此处需确定待加入5×SDS的量。计算含20-50ug蛋白样品的溶液体积即为上样量。先根据所算出来的蛋白浓度确定含20-50ug蛋白样品的溶液体积，再按蛋白样品：5×SDS上样缓冲液=4:1（此时5×SDS的浓度为1×）的比例算出5×SDS的加入量。等算出这个，可以把蛋白样品按这个量分装好冻到-80℃，跑电泳时可以直接拿出来用已知蛋白含量的变性样品。 SDS电泳 制胶（分离胶8%，浓缩胶4%）（见附表） 2.清洗玻璃板，晾干备用。（洗衣粉-自来水-蒸馏水，至不挂水珠为止） 3．灌胶：在光线明亮处，装好垂直电泳槽模具，检验玻璃板不漏胶（可先灌进去一点分离胶，稍等片刻，观察其是否漏），用1ml移液器在玻璃板夹层中沿玻璃板一角缓慢添加分离胶（5ml），至玻璃板中上部，需缓慢进行，以确保玻璃板中无气泡产生。灌完分离胶后往玻璃板中继续添加超纯水，使制胶版完全被超纯水封闭。静置45min（20-30min?），直至在超纯水与分离胶交界处肉眼可见一条明显的折射线。将制胶版略微倾斜，用移液器吸出超纯水，并用吸纸吸去制胶版板壁上残留的水滴。用1ml移液器在制胶版右角上缓慢添加4%浓缩胶（2-3ml）至制胶版被完全封闭。将梳子垂直插入制胶版浓缩胶中，用移液器向梳子缝隙中缓慢加入浓缩胶，至空隙被完全填满。室温静置约50min，直至在浓缩胶与分离胶交界处肉眼可见一条明显的折射线，将梳子缓慢垂直取出并将制胶版用电泳夹夹好放入电泳槽。 3．加足够的电泳液（加至淹没内面玻璃板）后开始准备上样。 4.上样 （1）蛋白变性：含20-50微克的蛋白样品中加该蛋白体积的1/4