基因工程-DNA诱变.pptVIP

（二）位点选择诱变 （altered sites in vitro mutagenesis） 位点选择诱变法使用了2个寡核苷酸引物，一个是用来引入突变的引物，另一个是用来选择用的。选择性引物可用来恢复有缺陷的抗生素抗性基因，同时可用来选择引入突变的DNA链。 特点：可正向选择突变链，使用高保真的T4DNA聚合酶合成DNA，可以使用双良DNA作模板，可进行多轮筛选。但需特定载体，即含有一个有缺陷的抗生素抗性基因。 （三）转化子诱变 （transformer site-directed mutagenesis） 转化子诱变也使用了2个寡核苷酸引物，除了突变引物外，还使用了1个用来剔除单一酶切位点的引物。因此该方法也称酶切位点剔除法。将待突变的DNA片段装载到克隆载体上，该载体上必须存在1个单一酶切位点。当这两个引物同时指导DNA合成时，突变的DNA链将不再含有该单一酶切位点，而模板DNA在该位置能被切割。通过转化大肠杆菌，线性化的模板DNA不能复制，只有突变保持环状，可以获得转化子。 * * * * * * * 第十章 DNA诱变 突变是研究基因结构与功能的最基本手段。 经典方法：分离自发突变体或用物理、化学诱变剂处理活体来获得突变，再根据突变体的表型，采用遗传学方法鉴定相应基因。 体外诱变：对克隆化的DNA进行诱变处理，改变其核苷酸序列，从而获得突变基因，用于基因工程、蛋白质工程等研究。 定向进化的原理 第一节 随机诱变 体外随机诱变：指随机地在克隆化DNA中引入碱基置换突变。 特点：不需要有序列针对性的合理设计，引入突变的位置随机； 结果：在目的DNA片段中引入大量的序列多样性； 方法：错误掺入诱变、增变菌株诱变、盒式诱变、化学诱变； 用途：诱变基因的编码区，改变氨基酸序列，从而改造蛋白质的性质或活性，得到符合需要的蛋白质。 定向进化：对于某些实验目的，一次突变很难获得满意的结果，通常采用反复多次诱变和循环，其目的是获得满足人们需要的性能改良的蛋白质，又称为试管进化。 一、错误掺入突变 概念：在体外DNA扩增中，使用具有错配倾向的DNA聚合酶以及反应条件，使碱基错误掺入到新合成的基因中，又称易错PCR（error-prone PCR）。 error-prone PCR的实质：通过改变PCR反应条件来调整PCR反应中突变的频率，降低聚合酶固有的突变序列倾向性，提高突变谱的多样性，使得错误碱基随机地以一定的频率掺入到扩增的基因中，从而得到随机突变的DNA群体，最后用合适的载体克隆突变基因。 易错PCR采用的方法： 增加MgCl2浓度到7mM，稳定非互补的碱基配对； 加入0.5mM的MnCl2，Mn 2+能降低聚合酶对模板的特异性； 增加聚合酶量到5U，促使在错配碱基处继续延伸反应； 限定4种碱基中的一种，通常为正常浓度的1-10%，在缺乏正确核苷酸时，DNA聚合酶经短暂停顿后，会插入另外3种可用核苷酸的一种； 3种为正常浓度的正常碱基，第四种为次黄嘌呤dITP（可与C、T、A配对）； 增加dCTP和dTTP的浓度到1mM，促进错误掺入； 使用突变DNA聚合酶，如Mutazyme。 二、盒式诱变 盒式取代诱变 混合寡核苷酸诱变 盒式取代诱变 种类 简单的盒式取代诱变是通过限制性酶切除去特定的双链DNA片段，再与含有突变的单一序列双链寡核苷酸连接,得到取代突变，是一种定点诱变。 混合寡核苷酸诱变 混合寡核苷酸诱变：若用于取代的是含有随机突变的混合双链寡核苷酸，则可在限定区域内引入大量的随机突变。 三、增变菌株的诱变作用 概念：与DNA错配校正功能和DNA损伤修复有关的基因突变后，细胞内基因的突变频率大大增加，这样的菌株叫增变菌株（mutator strain）。 常用增变菌株：E.coli XL1 - Red (mutD mutS mutT) mutD突变造成DNA聚合酶Ⅲ的3’→5’外切核酸酶活性缺陷，失去错配碱基的校正功能； mutS突变使DNA错配修复系统失去功能； mutT突变不能水解dGTP的氧化产物8-oxodGTP， 8-羟基鸟嘌呤在复制时掺入DNA中，造成突变。 四、化学诱变 用化学诱变剂处理双链DNA片段，将发生随机突变的片段群体克隆到合适的宿主中，构建成一个重组突变体库。用适当的功能分析可鉴别携带突变的重组子。 常用的化学诱变剂： 1. 烷基磺酸盐和烷基硫酸盐——甲基磺酸乙酯（EMS）、硫酸二乙酯（DES） 2. 亚硝基烷基化合物——亚硝基乙基脲（NEH）、N-亚硝基-N-乙基脲烷（NEU） 3. 次乙胺和环氧乙烷类——乙烯亚胺（EI） 4. 芥子气类——氮芥类、硫芥类??? 　　  烷化剂 作用机制——作用重点是核酸，导致DNA断裂、缺失或修补。 这类化合物具有与DNA碱