木瓜蛋白酶提取实验方案.doc

实验设计 题目：木瓜蛋白酶的提取,纯化分离及其生物学研究 实验原理： 木瓜蛋白酶（papain）又称木瓜酶，广泛存在于番木瓜的根、茎、叶和果实，未成熟果实的乳汁中含量最丰富。是一种含疏基（-SH）肽链的内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力；同时还具有合成的功能，能把蛋白水解物合成为类蛋白质。工业用的木瓜蛋白酶一般都是未经纯化的多酶体系。现已知经木瓜乳汁干燥而得的木瓜蛋白酶至少含有四种主要酶类：木瓜蛋白酶（papain）、木瓜凝乳蛋白酶（chymopapain）、木瓜蛋白酶Ω（papaya proteinaseΩ）、木瓜凝乳蛋白酶M（chymopapain M），其中木瓜凝乳蛋白酶的含量最多，占可溶性蛋白的45%。 木瓜蛋白酶易溶于水和甘油，水溶液为无色或淡黄色，有时呈乳白色；几乎不溶于有机溶剂。它的最适pH值为5.7（一般3～9.5皆可），在中性或偏酸性时亦有作用；最适温度为55～60℃（一般10～85℃皆可），耐热性强，在90℃时也不会完全失活；受氧化剂抑制，还原性物质激活。本实验主要采取有机溶剂沉淀法结合硫酸铵分级沉淀法来提取番木瓜中的木瓜蛋白酶。 有机溶剂沉淀法：有机溶剂能降低溶液的电解常数，从而增加蛋白质分子上不同电荷的引力，导溶解度的降低，另外，有机溶剂与水的作用，能破坏蛋白质的水化膜，故蛋白质在一定浓度的有机溶剂中的溶解度差异而分离的方法。有机溶剂分段沉淀法它常用于蛋白质或酶的提纯。使用的有机溶剂多为乙醇和丙酮。高浓度有机溶剂易引起蛋白质变性失活，操作必须在低温下进行，并在加入有机溶剂时注意搅拌均匀以避免局部浓度过大。 硫酸铵分级沉淀法：硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。 二、实验材料与仪器： 材料：未成熟的番木瓜，无水乙醇，0.05mol/L磷酸氢二钠; 0.1mol/L HC1，乙二胺四乙酸二钠固体；氢氧化钠固体，酪蛋白pH计，紫外分光光度计，高速冷冻离心机，精密电子天平，低温冰箱。 三、技术路线 四、实验步骤 4.1实验前准备：所需试剂的配制以及考马斯亮蓝G-250法测蛋白含量的预实验，确保试验方法的可行性。 考马斯亮蓝G-250染液（0.01%）：称取0.1g考马斯亮蓝G-250固体粉末，溶于50mL 95%乙醇中（95%乙醇取实验室无水乙醇47.5mL加2.5mL蒸馏水）再加入86% 磷酸100mL，倒入1000mL容量瓶加蒸馏水定容至1000mL。静置1h后，取棕色试剂瓶用乙醇清洗干净用滤纸过滤溶液后封存。 标准蛋白质溶液（0.1mg/mL）:准确称取牛血清蛋白0.01g用蒸馏水溶解并稀释到100mL。现配现用。 酶保护剂：准确称量1.21g的半胱氨酸于100ml蒸馏水中，调节PH至9.0，溶解半胱氨酸，再加入0.1871g的EDTA，定容至250ml，转入棕色瓶中。 500ml的2%(m/v)碳酸氢钠和 1mmol/L EDTA(pH 8.0)溶液1mmol/L EDTA(pH 8.0)溶液 ①用薄的不锈钢刀片沿未成熟的番木瓜的纵线将果皮割破，深度为2~3mm，根据果实大小的不同，每个果实可以5~10条刀口。 ②将木瓜放于一个大烧杯中，使木瓜乳汁流入大烧杯中。 ③收集10ml乳汁加入190ml蒸馏水水，匀速轻柔搅拌1h，得浆液。 ④浆液用8层纱布进行过滤,将所得液分装到离心管中，用离心机在3500r/min的条件下，离心15min。 ⑤收集上清液至一洁净的试管中，既得木瓜蛋白酶原液，-20℃存取10ml酶原液（编号为酶液1）。 4.2.2粗酶液纯化： 将粗液放入冰桶中，加入适量酶保护剂（0.04mol/L的半胱氨酸和0.004mol/L的EDTA），混匀后如下表加入试剂。00r/min 离心 30 min ,取沉淀，分别加加10ml蒸馏水 取1ml酶液（酶液3），-20℃保存 9+1 置冰桶中 2.5 静置30min, 离心4000r/min, 30min，弃沉淀 2.7 静置30min, 离心4000r/min, 30min，取沉淀，加入10ml蒸馏水 取1ml酶液（酶液4），-20℃保存 透析袋处理 取酶液并编号酶液6，-20℃保存 酶原液4 编号酶液5，-20℃保存 透析袋处理 取酶液并编号酶液7，-20℃保存 4.2.3透析： 8000-14000标号的透析袋处理： ①取透析