动物组织基因组的提取精要.ppt

组织匀浆液 （装入10ml离心管中） 10ml 100mmol／L NaCl：0.2ml（5M NaCl） 25 mmol／L EDTA(pH8.0)： 0.5ml（ 0.5M EDTA pH8.0) l0mmol／L Tris· HCIpH 8.0)：0.1ml（1M Tris· HCIpH 8.0) 加三蒸水: 9.2ml 计算方法： 5 mol／L NaCl 100mmol／L 5 mol／L× x ＝ 0.1mol／L ×10ml 0.2ml 实验一、动物组织基因组DNA提取 实验一 动物基因组DNA的提取 一、实验目的 学习和掌握从动物组织或细胞中提取核酸的原理和操作技术 了解提取DNA的几种方法，原理和优缺点 学习测定DNA含量和质量的基本原理及方法 二、实验原理 1、核酸的分类 DNA (脱氧核糖核酸) 主要存在于细胞核的染色体中。 核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNA。 RNA（核糖核酸） 存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。 除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬 菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。 核酸的理化性质 在细胞内通常与蛋白质结合，以复合物形式存在 2、核酸制备的一般原则 微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有机溶剂 在酸性溶液中容易降解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。 DNA溶液粘度很大，RNA的粘度较小 在强大离心力的作用下，可以从溶液中沉降下来 分离纯化核酸总的原则： 2、核酸制备的一般原则 核酸纯化应达到的要求： ①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； ②其它生物大分子的污染应降低到最低程度； ③排除其它核酸分子的污染。 ①应保证核酸一级结构的完整性； ②排除其它分子(蛋白，脂类，多糖类)的污染。 核酸制备时应注意的事项: ①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。 ②减少化学因素对核酸的降解。 ③减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温 ④防止核酸的生物降解：排除核酸酶。 ⑤排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时，应去除RNA，反之亦然。 降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。 对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。 对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。 核酸酶的抑制和抑制剂 DNase抑制 ①加入少量金属离子螯合剂，如0.01 mol/L EDTA或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。 ②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。 RNase抑制 ①操作要带手套。 ②所有器皿要严格消毒， ③试剂处理 ④低温操作 ⑤在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。 常用的RNA酶抑制剂 焦磷酸二乙酯（DEPC） 抑制强烈、不彻底 异硫氰酸胍 有效抑制、分解核蛋白 氧钒核糖核苷复合物 有效抑制 RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin） 有效抑制 其它：SDS、尿素、硅藻土等 有效抑制 核酸制备中常用的去垢剂 核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂。 去垢剂的作用： 1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 2．溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来； 3．对RNase、DNase有一定的抑制作用。 如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠 作用： 1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。 2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。 3.某些蛋白质变性剂也有抑制 RNase活性和破裂细胞的作用。 如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC 核酸制备中常用的蛋白质变性剂 核酸制备中常用的酶 DNase:降解DNA