动物细胞培养技术精要.ppt

动物细胞培养技术 1.动物细胞的生长与培养 动物细胞的特点 进化程度高 结构、形态、成分复杂 细胞间连接形式多样 生长相对缓慢 功能全面 1.2 细胞培养总原则 (一) 细胞培养无菌无毒环境 实验室设计合理 常用设施及设备 培养器皿： 透明度好、无毒、利于细胞贴附和生长的材料，常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品。 细胞培养无菌操作基本技术 工作环境及表面的处理 细胞培养所用玻璃及塑料制品的处理 培养液与培养细胞的处理 (二) 细胞的营养 培养基：合适的细胞培养基是体外细胞生长增殖的最重要的条件之一，培养基不仅提供细胞营养和促使细胞生长增殖的基础物质，而且还提供培养细胞生长和繁殖的生存环境。 血清：血清是细胞培养液中最重要的成分之一，含有细胞生长所需的多种生长因子及其它营养成分 。 其它成分（条件培养基） 合成培养基的主要成分 氨基酸 碳水化合物 无机盐 维生素 其它辅助物质 血清 牛血清、马血清、人血清 （1）储存于-20℃ — - 70℃ 低温冰箱中 （2）一般厂商提供的血清为无菌 （3）热灭活是指56℃, 30 分钟加热已完全解冻的血清，目的是使血清中的补体成分（complement）灭活 （4）血清中的沉淀物絮状物，可用离心3000rpm, 5 分钟去除，也可不用处理。 其它常用液体试剂 Hank’s D-Hank’s PBS NaHCO3（ 7.5% ） 胰酶溶液（0.25%） (三) 其它类似体内的环境 (四)合理的计划，维持细胞性状  一、细菌污染 细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细 胞培养液中加入了抗菌素(一般为预防剂量)，也可能 因为操作不慎而引起污染。最常见的有革兰氏阳性菌。 培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改 变。也有的培养液肉眼观察无多少改变，只能在镜下 发现菌体才知污染。所以，每天应仔细观察。污染后 细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆 脱落死亡，造成试验失败和细胞株(系)丢失。 二、真菌污染 真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其在霉雨季节 进行细胞培养更易污染。最常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔 子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。 培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的 小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下 可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基 中，有的呈链状排列。念珠菌和酵母菌呈卵圆形散在细胞周边 和细胞之间。个体细小，有增多趋势。镜下看时，要将培养瓶 用酒精棉球擦干净，以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相 混淆。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒 性作用而使细胞脱落死亡。 三、支原体污染 支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微 生物，最小直径0.2μm，一般过滤除菌无法去除 它，光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发 现，能在偏碱条件(pH7.6～8.0)下生存，对青霉素 有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。 电镜下可见其有三层结构，无细胞壁，中央有电子 密度大的密集颗粒或丝状的中心囊。 培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生 长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细 胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理， 还会产生交叉污染。 四、病毒污染 采用组织细胞培养法生产疫苗，如果没有除去潜在 病毒的组织培养物，会产生病毒污染。目前，从原 代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。 尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗 是不安全的。若二倍体细胞系有SV40或多发瘤病 毒，B淋巴细胞含EB病毒，细胞会发生变异、转 化，形成异倍体的细胞系。 五、非同种细胞污染 由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没 有严格分开，操作不当，往往会使一种细胞被另一 种细胞污染。如“灵长类”细胞系发现猴和鼠类细胞 的混合物，ERK/KD细胞是从兔肾中分离出来的， 而现在却认为是HeLa细胞。 非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发 生，大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底 而带入一些有毒化学物质所致。 常用的排除微生物污染的方法 抗生素排除法：采用5～10倍于常用量的冲击法，加入高浓度抗生素后作用24～48h，再换入常规培养物，有时可能奏效。 加温除菌：根据支原体不耐热的特点，可将受支原体污染的细胞至于41摄氏度作用5～10h（最长可达18h），以杀灭支原体。 动物体内接种：受污染的肿瘤细胞可接种在同种动物皮下或腹腔内，利用动物的免疫功能消灭污染的微生物，而肿瘤细胞却能在动物体内继续生长，待一定时间后从体内取出肿瘤细胞进行培养 与巨噬细胞共培养：巨噬细胞在体外可存活7～10天，并保持吞噬、消化微生物的能力。利用这一特