细胞异质性(单细胞分析).docx

细胞异质性（单细胞技术）单细胞分析方法显示在FMDV感染过程中，细胞与细胞间在病毒RNA水平上存在很大的差异性为了研究在FMDV复制过程中的细胞异质性，我们应用单细胞方法分析被感染的细胞（图1-1）。首先用0.0001/0.001moi FMDV感染群体BHK-21细胞，感染24h后，胰酶消化细胞，通过FACS分选被感染的单细胞，反复冻融裂解细胞，获得细胞RNA，然后通过RT-qPCR检测病毒正链RNA和负链RNA.FACS sorting96-Well PCR plateRT-qPCRBHK-21 cellsFMDV infectionns=79 图1-1单细胞分选及检测方法的示意图 A B ns=46 ns=46 C D图1-2不同感染滴度急性感染单细胞RNA分布图A：在0.0001moi或0.001moi FMDV感染BHK-21细胞中，单细胞病毒正链RNA的分布图。 ns代表分析的单细胞数目。 B：在0.001moi FMDV感染BHK-21细胞中，单细胞病毒负链RNA的分布图。C：在0.001moi FMDV感染BHK-21细胞中，病毒正链RNA与负链RNA的比值分布图。 D：在0.001moi FMDV感染BHK-21细胞中,病毒正链RNA与负链RNA的相关性。R2=0.945 在0.0001moi FMDV感染BHK-21细胞中，我们分析了84个单细胞RNA分布情况，这些细胞中有13个未检测到正链RNA,剩下的细胞正链RNA检测值从22到2427000copies/cell (图1-2A) ,平均值为43400 copies/cell，由于大多数单细胞负链RNA拷贝数处于检测下限以下，因此在这里没有分析。因此我们可以看出单细胞RNA拷贝数是极其分散的，有的细胞产生很少的RNA甚至没有，有的细胞产生极多的RNA。 由于在0.0001moi感染条件下检测不到负链RNA，因此我们通过增加感染滴度来完成实验。在0.001moi感染条件下，我们也分析了84个单细胞RNA分布情况，这些细胞中有13个未检测到正链RNA,剩余的细胞正链RNA检测值从7到1594000copies/cell (图1-2A) ,平均值为69700 copies/cell，同时分析了单细胞负链RNA拷贝数，分5次进行，共检测了468个单细胞，仅79个能够被检测到，最低值8 copies/cell，最高值3363283 copies/cell，平均值为82116 copies/cell（图1-2B）。因此我们可以看出细胞间正链和负链RNA的差异非常大，有的细胞产生很少的RNA甚至没有，有的细胞产生极多的RNA。同时发现用0.0001moi感染24h后的单细胞正链RNA拷贝数大多集中于102-103，而0.001moi感染24h后的单细胞正链大多集中于104-105。 同时我们分析了单个FMDV感染细胞的正负链比值，由于负链检测的不灵敏性，为确保准确性，我们选取负链RNA高于1000copies 的单细胞进行正负链比值分析，共46个单细胞，比值从4到239，主要集中在10-40间，单细胞正负链比值平均值为38（图1-2C）。Schulte Andino研究10moi PV感染7h后单细胞正负链比值，作者分析了106个单细胞，正负链比值分布从2-200，比值平均值为20(1)。由于病毒、感染滴度及感染时间的差异性，比值略有不同。我们利用这些单细胞结果，同时分析了单细胞正负链的相关性，结果发现在0.001moiFMDV感染24h的情况下，单细胞负链与正链具有很好的相关性，相关系数R2=0.945（图1-2D）。 综上结果表明，单细胞分析方法显示在FMDV感染过程中，细胞与细胞间在病毒正链及负链RNA水平上存在很大的差异性，同时正链与负链RNA存在很好的相关性。2、细胞大小对FMDV急性和持续感染的影响 在病毒感染过程中，病毒是依赖宿主细胞这个生物合成工厂来复制的。我们推测也许大的细胞比小的细胞拥有更多的生物合成资源，使得病毒的复制与细胞的大小相关。前人的研究已经证明forward scattering（FSC）的强度和细胞大小正相关，我们通过使用流式细胞仪将细胞分为三个群体，分别是forward scattering (FSC)- high，medium，low群体（图2-1），来代表细胞的大小{Zhu, 2009 #9}。 为了研究病毒的翻译是否与细胞的大小相关，0.01moi FMDV感染BHK-21细胞24h，用FMDV 3D蛋白多克隆抗体和FITC标记二抗进行免疫荧光，流式分析。发现FSC-High，FSC-Medium，FSC-Low细胞的3D蛋白阳性率分别为83.11%，34.4%，18.9%（图2-1），表明细胞越大，含有病毒3D蛋