选修三专题一《基因工程》第一节《DNA重组技术的基本工具》.doc

选修三专题一《基因工程》 第一节《DNA重组技术的基本工具》 一、基因工程的基础知识： 1.含义：一个物种中的某基因（目的基因）转移到另一个物种中并表达。 2.其他名称：DNA重组技术，转基因技术。 3.实施场所：体外。 4.水平：分子水平。 5.目的和优点： （1）目的性强，能定向改造生物的性状。 （2）在不同物种之间进行，不受生殖隔离的限制。 二、基因工程的工具： 1．工具一：限制酶（限制性核酸内切酶）。 （1）来源：主要从原核生物中获得。 （2）种类：约有4000多种。 （3）作用特点：一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并从特定部位的两个核苷酸之间 的磷酸二酯键切开。因此具有专一性（特异性）。 （4）磷酸二酯键：指位于磷酸和脱氧核糖之间的键。 （5）切割后产生的末端：产生黏性末端（主要）或平末端。 （6）同一种限制酶切割后产生相同的黏性末端，它们能互补配对。 2．工具二：DNA连接酶。 （1）作用：将互补配对的两个黏性末端或平末端之间的磷酸二酯键连接起来。 （2）种类及区别： E·coliDNA连接酶（从大肠杆菌中分离获得），只能连接黏性末端。 T4DNA连接酶（从T4噬菌体中分离获得），既能连接黏性末端，也能连接平末端（效率低）。 （3）两类DNA连接酶的相同点：都连接磷酸二酯键。 （4）学过的几种酶的比较：解旋酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶、限制酶、DNA连接酶。 解旋酶：氢键（断裂） 限制酶：磷酸二酯键（断裂） DNA聚合酶：磷酸二酯键（连接一个脱氧核苷酸和一个DNA片段） DNA连接酶：磷酸二酯键（连接两个DNA片段） 3．工具三：载体。 （1）载体的种类：质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒。 （2）最常用的载体：质粒。 （3）质粒的本质：主要存在于原核细胞中独立于拟核外的有自我复制能力的双链小型环状DNA。 （4）载体具备的条件： 第一、能自我复制（便目的基因的复制） 第二、有一个或多个限制酶的切割位点（便于插入目的基因）。 第三、有标记基因（便于目的基因的检测与筛选）。 强调：标记基因主要是一些抗生素基因，如：四环素抗性基因，青霉素抗性基因等。 （5）载体一般都是经过改造的质粒。 第二节《基因工程的基本操作程序》 基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤： 1、目的基因的获取， 2、基因表达载体的构建 3、将目的基因导入受体细胞， 4、目的基因的检测与鉴定。 一、第一步：目的基因的获取： 1、目的基因：主要是指编码蛋白质的基因。 2、获取目的基因的方法： （1）从基因文库中获取目的基因（是从自然界中直接分离目的基因的最主要方法）。 a. 基因文库的含义：将含有某种生物不同基因的的许多DNA片段，导入受体菌的群体中 储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。 b. 基因文库的种类： 一类叫基因组文库，指含有一种生物的所有基因（将全部DNA用限制酶切割）。 另一类叫部分基因文库，指含有一种生物的一部分基因，如cDNA文库（利用mRNA 反转录得到的DNA）。 c．从基因文库中获取目的基因时可依据目的基因的哪些信息？基因的核苷酸序列、基因的 功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA、基因的表达产物蛋白质等。 （2）利用PCR技术扩增目的基因（是人工合成大量目的基因的最主要方法）。 a. PCR技术的含义：是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。 b. PCR技术的原理：DNA复制。 c. PCR技术的条件：模板、原料、酶、能量、引物。具体如下： 模板：是提供的目的基因， 原料：是四种游离的脱氧核苷酸， 酶：是热稳定性强的DNA聚合酶， 能量：是ATP， 引物：是一个已知核苷酸序列的DNA引物。 d．过程：三个阶段不断循环进行，使DNA快速增多 。 第一阶段：高温变性：加热至90～95℃时，解旋成两条单链。 第二阶段：低温复性：冷却至55～60℃时，引物结合到单链DNA上。 第三阶段：中温延伸：加热至70～75℃时，合成新的子链。 e. DNA数量的增加方式：指数式扩增=2n（n为扩增循环的次数） （3）用DNA合成仪直接人工合成：适合基因较小、核苷酸序列已知的DNA片段。 二、第二步：基因表达载体的构建：这一步骤是基因工程的核心。 1、构建基因表达载体的目的： 使目的基因在受体细胞中能稳定存在，能遗传给下一代；并能表达和发挥作用。 2、基因表达载体的组成：目的基因 十 启动子 ＋ 终止子 十 标记基因。 （1）启动子：是一段特殊的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别并结合的部位， 作用是驱动基因转录产生mRNA。 （2）终止