10第十二章教学.ppt

表- 某些真核生物的细胞周期时间 细胞周期各时相的合成活动 ： G1是细胞周期第一个间隙，主要合成rRNA、蛋白质、脂类和碳水化合物，它为DNA合成作准备 (gap1)。 S是DNA 合成时期(synthesis phase)。组蛋白, DNA复制所需的酶。 G2是DNA合成后期至核分裂开始之间的第二个间隙(gap2)。大量合成ATP、RNA、蛋白质, 包括微管蛋白和成熟促进因子MPF等，为有丝分裂作准备。 M 是细胞分裂时期 (mitosis)。RNA合成停止, 蛋白质合成减少, 以及染色体高度螺旋化。 利用条件突变体 在正常条件下，细胞表现出正常功能，但在某些条件下，功能出现异常，表现出突变的表型，将此类突变体称为条件突变体（株）。 条件突变体（株）在限定条件下培养，可获得同步化的细胞。例如芽殖酵母，裂殖酵母在限定温度下，可以停留在G2/M和G1/S交界处。 细胞周期调控中的一些关键问题： 细胞如何准确地复制遗传物质及传给子细胞的？ 调节细胞周期的关键调控因子是什么？ 细胞周期是如何调控的？ ?细胞融合实验 ◆研究者：1970年，Colorado 大学的Potu Rao 和 Robert Johnson ◆研究方法：使用的细胞系HeLa融合 ●早熟染色体凝集(premature chromosome condensation,PCC ）或称染色体超前凝集。 ?MPF的发现 成熟促进因子(maturation promoting factor，MPF）,早期称为M-期促进因子(M-phase promoting factor, MPF)，是指M期细胞中存在的促进细胞分裂的因子。 ●非洲爪蟾和无脊椎动物的卵母细胞及早期的胚细胞也证实MPF的存在 三、细胞周期蛋白的鉴定 1983年Timothy Hunt首次发现海胆卵受精后，在其卵裂过程中两种蛋白质的含量随细胞周期剧烈变化，故命名为周期蛋白(cyclin)。后发现各类动物来源的周期蛋白mRNA均能诱导蛙卵的成熟。 ◆实验方法 ●获得同步化的受精的海胆卵细胞 ●在有放射性氨基酸的培养液中培养 ●每10分钟取一次样分离纯化蛋白质进行分析 ◆实验结果 在细胞周期中周期蛋白和MPF的波动 ?MPF的结构组成 Paul Nurse（1990） ◆是一种蛋白质激酶，由两个不同的蛋白质（亚基）组成的异质二聚体，可使多种蛋白质磷酸化: ●催化亚基:p32, cdc蛋白是p32的同源物 ▲是丝氨酸/苏氨酸型蛋白激酶 ▲其活性有赖于周期蛋白，故蛋白称为周期依赖性蛋白激酶(cyclin-dependent protein kinases,CDKs); ●调节亚基：p45,周期蛋白(cyclin)是p45 的同源物。 ?周期蛋白的泛素化降解途径 ◆多聚泛素化作用(polyubiquitination) ●泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme, E1) ●泛素结合酶(ubiquitin-conjugating enzyme, E2) ●泛素连接酶(ubiquitin ligase, E3) ◆促后期复合物（后期促进因子） (anaphase-promoting complex, APC) ?APC活性变化是认识细胞分裂中期向后期转化的关键点,通过APC活性变化调控周期蛋白B的降解和有丝分裂的退出。 ◆当MPF的活性在有丝分裂中期达到最高峰时, 它将APC磷酸化并将其激活； ◆接着发生周期蛋白B多聚泛素化, 引起周期蛋白B的降解； ◆由于周期蛋白B是MPF的一个必需亚基, 它的降解势必导致MPF的逐渐失活； ◆在G1期的后期,APC完全失活,使得周期蛋白B的浓度升高,同时提高MPF的活性, 以便进入下一个有丝分裂期。 ?真核生物细胞周期调控的关键时期： ◆三个关键的过渡： ●G1期→S期：Cyclic D- CDK4，6， Cyclic E- CDK 2， Cyclic A - CDK 2 ●G2 → M期： cyclinB （A）- CDK1 ●中期→后期及胞质分裂期过渡： cyclinB的降解 ◆两类周期蛋白-CDK复合物: ●G1期周期蛋白-CDK复合物 ●有丝分裂M期周期蛋白-CDK复合物 2、CDKI CDK?inhibitor( CDKI): 细胞周期蛋白依赖性激酶 抑制因子,对细胞周期起负调控作用. 目前发现的CDKI分为两大家族: ①Ink4(Inhibitor of CDK4): P16ink4a、P15ink4b、P18ink4c、P19ink4d