生物大分子：DNA讲解.ppt

拓扑异构酶I: 通过一步改变DNA的连环数，不需要ATP。 使DNA暂时产生单链缺口，让未被切割的一条单链在切口结合之前穿过这一切口。 拓扑异构酶II：通过两步改变DNA的连环数，需要ATP提供能量。 在DNA上产生瞬时双链缺口，并在缺口闭合以前使一小段未被切割的双链DNA穿越这一缺口。 对环状DNA分子而言，在DNA 复制完成之后，拓扑异构酶能解开这些DNA，以便使它们在细胞分离时分配到两个子细胞中。 解链 链接 真核生物的长线性染色体也存在拓扑结构，通常拓扑异构酶II催化的DNA解缠绕，也是DNA成功复制和真核细胞分裂必需的。 DNA的拓扑异构体可以通过电泳分离 长度相同而连环数不同的共价闭合环状DNA分子叫做DNA的拓扑异构体。 通过凝胶电泳可以将它们彼此分开。 DNA拓扑异构体的 电泳分离图 环状DNA 线性DNA 高度超螺旋DNA D泳道：拓扑异构体梯度标记 利用荧光染料观察凝胶中的DNA 溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的DNA。 溴化乙锭用标准302nm紫外光透射仪激发并放射出橙红色信号，观察琼脂糖凝胶中DNA最常用的方法是利用荧光染料溴化乙锭进行染色。 溴化乙锭（ 3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐，EB）： 松弛的环状 (有时1条链发生断裂) 线状 （2条链发生断裂） 共价闭合环状超螺旋 溴化乙锭（EB）可以嵌入核酸分子的碱基对平面之间，在紫外光照射下发出橙黄色的荧光，常作为染料检测核酸的存在。 质粒DNA酶切产物琼脂糖凝胶电泳图 1:酶切产物； M: DNA Marker 1 M （1）EB能插入DNA分子碱基对之间，该染料灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出，紫外透射仪下观察呈橙红色。 （2）使用时，可以加到凝胶中，由于EB在60~70℃以上温度蒸发，所以最好不要在胶太热的时候加；也可以在电泳结束后，将凝胶用EB染色。 （3）EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。 （4）含EB废胶的处理，含量低于0.1%可以丢弃，否则需要焚烧；废液要视EB含量（10ug/ml以下可以直接丢弃）进行不同的处理后才能丢弃。 溴化乙锭（ EB）的特点和使用 对于EB含量大于0.5mg/ml的溶液，可如下处理： ①将EB溶液用水稀释至浓度低于0.5mg/ml； ②加入一倍体积的0.5mol/L KMnO4，混匀，再加入等量的25mol/L HCl，混匀，置室温数小时； ③加入一倍体积的2.5mol/L NaOH，混匀并废弃。 紫外线可损伤眼视网膜，切勿用裸眼和没有防护装置的紫外光源。 在实验室里常用的紫外光源包括手提式紫外灯和紫外透射仪。必需通过吸收有害波长的滤片或安全玻璃片才能观察。 在从凝胶中回收DNA条带的操作中，要尽量减少暴露在紫外线下的时间。 紫外线及其防护 紫外透射仪 手提紫外分析仪 凝胶成像系统 4 . DNA的提取 提取原则：保持一级结构的完整性，将其他生物大分子的污染降到最低。 提取流程： 破碎细胞 DNA释放到水相 去垢剂或蛋白变性剂抽提 除去蛋白等杂质 DNA沉淀 DNA溶解和保存 DNA的保存： 温度： 大分子量的基因组DNA多在4℃，长期保存则在-70℃，常用的保存温度多用 -20℃. 介质： TE缓冲液最常用 DNA提取中常用的酶： RNA酶A， 蛋白酶K，溶菌酶 DNA提取的关键： （1）DNA分子较大（尤其是基因组DNA），应注意防止机械张力将其打断，所以操作要轻柔，离心速度要控制。 （2）要灭活DNA酶，采用0.01M的EDTA或者柠檬酸钠处理，或者用去垢剂（SDS）、蛋白变性剂（苯酚、氯仿等）就可以基本灭活，此外，55 ℃处理也经常用于灭活残余的DNA酶。 分子生物学中常见的DNA提取： 1. 基因组DNA提取，后续实验包括建基因组文库；PCR扩增基因的编码区、启动区；Southern杂交 2. 质粒DNA的提取，后续实验包括重组载体构建、鉴定（最常用） 3. 叶绿体DNA提取，后续实验主要和叶绿体基因组编码基因功能研究有关，例如：光合作用相关的基因 4. 线粒体DNA提取，后续实验包括线粒体基因组编码基因功能的研究，例如：能量代谢相关的基因、线粒体疾病基因的克隆等 思考题 1. DNA分子在结构上为什么最适合作为遗传信息载体？ 2. DNA提取操作要点是什么？ 3. DNA提取和鉴定的相关操作中需要注意什么？ 分子生物学 生物大分子 问题1： 大分子的结构如何与功能相适应？ 问题2： 大分子的提取应考虑哪些因素？ 一、DNA 1. DN