6.实验六质粒的提取琼脂糖凝胶电泳检测6.实验六质粒的提取和琼脂糖凝胶电泳检测.ppt

一、实验目的 了解高纯质粒小量制备试剂盒和碱法提取质粒的原理 掌握百泰克高纯质粒小量制备试剂盒方法提取质粒的方法 实验原理（碱法） 质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子。 碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法。 这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。 三、实验仪器、材料与试剂 （一） 仪器 恒温摇床 超净工作台 高压灭菌锅 高速台式离心机 微量取液器、 1.5mLEP管 LB液体和固体培养基 卷纸、无水乙醇、双蒸水 五、实验结果与讨论 1. 实验结果 2. 讨论 附I：碱法提取质粒的原理和方法 (一)试剂等 1. SolutionⅠ 　 50 mmol/L 葡萄糖 　 25 mmol/L Tris.·Cl (pH 8.0) 　 10 mmol/L EDTA (pH 8.0) 高压灭菌后，4℃保存备用。 2. SolutionⅡ(现用现配制) 0.2 mol/L NaOH 　 1% SDS （二）实验步骤 用灭菌的牙签挑取单菌落放入50ml LB液体培养基（含Amp 0.1 mg/ml ）中，37℃振荡培养过夜。 将菌液倒入1.5 ml Eppendorf管中，10,000 rpm离心1min，去掉上清液，重复两次。 沉淀悬于200μL SolutionI 中, 涡旋使充分悬浮。 加入300μL SolutionII，混匀（注意动作轻），冰箱3 ℃放置5 min。 加入300μL SolutionIII,混匀（注意动作轻） ，冰箱3 ℃放置5 min。 12,000rpm，离心5min，将上清移至1个新Eppendorf 管中，注意所取体积（约600 μL ） 。 加入等体积氯仿（约600 μL ），混匀（注意动作轻）。12,000rpm，4℃，离心10min，取上清液。 上清液中加入预冷的等体积异丙醇，-20℃沉淀 20~30 min。 12,000 rpm离心15 min。 去上清，沉淀加入500μL 70%乙醇洗涤2次（ 12,000 rpm离心3分钟）。 (三)实验结果及讨论  碱法提取质粒是实验室最常用的质粒提取方法之一，提取量较大，便于操作。 如有蛋白质残留，干燥后不透明，而呈白色。 * * 实验一 质粒的提取和琼脂糖 凝胶电泳检测 (高纯质粒小量制备试剂盒方法,百泰克) 实验目的 实验原理 实验仪器、材料与试剂 实验步骤 实验结果及讨论 二、实验原理 (百泰克高纯质粒小量制备试剂盒方法) 本试剂盒在室温储存18个月不影响使用效果。 一、原理简介本试剂盒采用改进SDS-碱裂解法裂解细胞，离心吸附柱内的硅基质膜在高盐、低PH值状态下选择性地结合溶液中的质粒DNA，再通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除，最后低盐、高PH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。 在碱性条件（pH12.5）下，线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕，紧密结合在一起。 当加入乙酸钾恢复至中性时，染色体DNA分子难以复性，而质粒DNA分子很快复性，离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来，而质粒DNA则留在上清液中。 用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤，可得到较纯的质粒DNA。 载体结构的三大要素： 多克隆位点 选择标记（耐药性，LacZ） 独立的复制单位 载体种类： 质粒 噬菌体 酵母人工染色体（YAC） 反转录病毒载体 表达载体等 pBC SK map （二） 材料和试剂 含pUM-T (pMD18-T或 KS，pRT101)质粒的大肠杆菌 DH10B（DH 5α或HB101）。 含外源基因的重组pUM-T (pMD18-T或 KS，pRT101)质粒的大肠杆菌 DH10B（DH 5α或HB101） 。 氨苄青霉素（Amp）：用无菌水配制成50-100 mg/ml 溶液，置-20℃冰箱保存备用。 pMD18-T Vector ???????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????????