植物病原细菌的分离.doc

植物病原细菌的分离、纯化及鉴定 1实验目的及意义 植物病原菌的分离、鉴定是植物病理学实验最基本的操作技术之一，通过本实验，要求掌握植物病原菌分离培养、纯化鉴定的一般原则和方法。 2实验材料及准备 2.1 实验材料：新发病的植物组织 2.2 培养基准备（LB培养基）：胰蛋白胨1%，NaCl 1%，酵母浸粉0.5%，pH7.0-7.2，121℃灭菌20 min，备用。 2.3 实验用具：载玻片、盖玻片、酒精灯，手术剪，镊子，培养皿（Φ9cm），斜面培养基，灭菌水，1%，打火机。 3 实验方法及步骤 3.1 植物样品的采集 选取发病初期植株，样本尽量保持完整，至少包含病健交界处；将样品放入纸袋保存或邮寄，并做好记录；需要分离的标本应尽快完成分离工作（1-5d），长期保存需压干，未压干的标本勿装塑料袋。 3.2 发病组织的显微检查 准备好洁净的载玻片、盖玻片和水；取小的整块标本洗净、晾干/吸干；切取约2×4mm大小病健交界组织；从上述组织中切取尽可能薄的小片平放在载玻片上；加一滴水，盖好盖玻片，防止气泡；先用低倍镜(4×，10×)检查，看到白色、半透明、雾状的喷菌现象；换用40倍物镜观察，看到杆状、透明、活动的菌体，证明的确为细菌性病害。 3.3 病原物的分离和培养 选取镜检有喷菌现象的组织进行划线分离：所取组织用自来水洗净，吸干；（以下进入超净工作台操作）将植物组织剪成1×4mm的大小，1%的次氯酸钠消毒2-10min，灭菌水洗2-3次；将组织从病斑处剪碎放入约0.5-1ml水中，并让组织碎块在水中浸泡5-15min，让细菌释放到灭菌水中；取病汁液1-3环，在LB平板上划线。28℃温箱中培养，每天观察菌落生长情况并记录：菌落长出的时间、菌落大小、颜色、形态。 3.4 病原物的纯化和保存 3-4 d后选取生长量较多且形态一致的菌落，LB平板上划线纯化。若仍然生长不纯，则需多次纯化。划菌采用三线法。挑取纯化后的单菌落移入斜面生长，每菌移3管。24小时后从斜面上再次转移菌体，并且保存该病原菌。 3.5 病原物的鉴定 利用基因组提取试剂盒提取细菌基因组，用通用引物将细菌16S rDNA序列扩增出来，长度1.5k左右。 16S rNDA通用引物：U8-27（F）5’-AGAGTTTGA TC(AC)TGGCTCAG-3’； L1494-1514（R）5’-CTACGG(AG)TACCTTGTTACGAC-3’ 25ul的反应体系：Buffer 2.5 ul Mg2+(25M) 3.75ul dNTP 2ul rTaq 0.5ul primer1 0.6ul primer2 0.6ul DNA 1ul ddH2O 14.05ul Total 25ul PCR反应条件：94℃ 5min 94℃ 1 min 56℃ 1min 30cycle 72℃ 2 min 72℃ 10 min 12℃ foever 将PCR产物送测序公司进行测序，然后将序列送至基因库中进行比对，同源性最高，且至少达到97％以上可认为是同一种。也可以将序列下载后用比对软件进行生物进化分析，可以看到与各菌种间亲缘关系。