土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 上课用精要.ppt

二.实验的具体操作 ㈠.土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。 ◆取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。 （二）制备培养基： 制备以尿素为唯一氮源的选择培养基。 牛肉膏蛋白胨培养基（作对照） ◆应在火焰旁称取土壤10g。 ◆在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行 ◆分离不同的微生物采用不同的稀释度 [三]土壤样品的稀释 ◆分离不同的微生物采用不同的稀释度 稀释倍数 目的 细菌 104、105、106 保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板 放线菌 103、104、105 真菌 102、103、104 原因：不同微生物在土壤中含量不同 由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。 由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基，因此共需要15个选择培养基，5个牛肉膏蛋白胨培养基。此外，还需要准备8个灭菌的试管和1个灭菌的移液管。 为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？ 原因：土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。 结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。 （四）取样涂布 ◆实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。 ◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30—300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。 每个稀释度下需要3个选择培养基（作重复组）， 1个牛肉膏蛋白胨培养基（作对照） ㈤.微生物的培养与观察 在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。 培养不同微生物往往需要不同培养温度。 细菌：30～37℃培养1～2d 放线菌：25～28℃培养5～7d 霉菌：25～28℃的温度下培养3～4d。 微生物的培养与观察 同种微生物有稳定的菌落特征：形状，大小，隆起程度，颜色 （六）鉴定：筛选后必鉴定 鉴别培养基：加入某种指示剂或化学药品，不影响微生物的生存 1、酚红培养基：鉴定分解尿素的细菌。 原理：脲酶催化尿素分解成氨→培养基碱性增强→ 酚红变红→脲酶阳性 2、伊红—美蓝培养基：鉴定大肠杆菌 原理：代谢产物与伊红—美蓝结合→ 菌落呈黑色并带有金属光泽。 CO(NH2) 脲酶 + CO2 NH3 + H2O 属鉴别培养基，它并没有促进大肠杆菌的生长和抑制其他微生物的生长 　　伊红—美蓝培养基是鉴别培养基，可以用来检测自来水中的大肠杆菌是否超标，因为的代谢产物与伊红—美蓝结合，使菌落呈深紫色并带有金属光泽，使大肠杆菌的菌落显示出来，并没有促进大肠杆菌的生长和抑制其他微生物的生长。 例如：鉴别大肠杆菌培养基 大肠杆菌呈黑色中心 ,有或无金属光泽 大肠杆菌在伊红美蓝琼脂(EMB)上典型特征 三、操作提示 无菌操作 做好标记 规划时间 （一）①培养物(即培养的目的菌种)中是否有杂菌污染? ②以及选择培养基是否筛选出菌落? 　　 ①对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。 ②牛肉膏蛋白胨培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。 四.结果分析与评价 　　如果学生选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，需要进一步分析产生差异的原因。 （二）样品的稀释操作是否成功 　　如果得到了2个或2个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。 （三）重复组的结果是否一致 操作 实验组 对照组 判断培养基中是否有杂菌污染 判断选择培养基是否具有筛选作用 选择培养基 接种 选择培养基 不接种 选择培养基 接种 牛肉膏蛋白胨培养基 接种 需将未接种的选择培养基同时进行培养 需设立牛肉膏蛋白胨培养基进行接种后培养，观察两种培养基上菌落数目、进行对比得出结 实验设计原则 (1)设立重复组： 统计某一稀释度下平板上的菌落数时，要至少涂布三个平板作重复组，增强实验结果的说服力与准确性。 (2)设立两种对照组： 栏目链接 四.结果分析与评价 2 2 本课题知识小结: 课后练习 2.提示：反刍动物