复旦大学课件-核酸化学2-DNA的结构和特性精要.ppt

复旦大学生物化学系 黄伟达 DNA的结构与特性Structure and Characters of DNA Watson-Crick的DNA双螺旋 DNA的分子形状 原核生物的基因组DNA（即染色体）、质粒（plasmid）DNA、一些病毒DNA、线粒体及叶绿体DNA，呈环状。 真核生物的染色体DNA，大部分噬菌体DNA，和一些病毒DNA，呈线状。 环状DNA引发的拓扑学问题 细菌质粒DNA的不同状态 松弛型 正螺旋和负螺旋 不同形状的DNA分子在琼脂糖中的迁移率 真核生物的DNA不裸露 DNA的一级结构分析 核酸的序列测定-DNA酶法测序 20世纪60年代，Holley首先测定了酵母Ala-tRNA的序列-重叠法，非常繁琐。 1975，Sanger采用加减法测定核酸序列，快速。 1977，Sanger改进了测定方法-末端终止法，更加快速。现在有各种自动化核酸测序仪，核酸测序更方便快捷。 DNA的序列测定（1）－化学法 Maxam /Gilbert法 DNA的序列测定（2）－ddNTP法 到2030年，预计只要1000美金就能得到个人的基因组序列。刷卡看病的时代即将到来。 注： 人与人之间平均 1000个碱基对就有一个碱基呈多态性(SNP)。因此共在300 万个碱基上可能存在差异。 重组DNA技术的基础Basis of Recombinant DNA Technology DNA与限制性内切酶 DNA的变性与复性 DNA分子的变性 DNA的变性在紫外吸收上的变化 盐浓度对DNA变性的影响 DNA分子的Tm与GC含量有关 DNA浓度与复性时间的关系 DNA复性与Cot分析 Cot曲线的另一种表达形式 人DNA的Cot曲线 分子杂交、PCR等技术简介 分子杂交(Hybridization) 不同来源的核酸变性后，合并在一起进行复性，这时，只要这些核酸分子的核苷酸序列含有可以形成碱基互补配对的片段，复性也会发生于不同来源的核酸链之间，即形成所谓的杂化双链(hybrid duplex)，这个过程称为杂交(hybridization)。 DNA的分子杂交技术 聚合酶链反应（PCR）原理 Maxam/Gilbert DNA 化学降解法 (1)先将DNA的末端之一进行标记(通常为放射性同位素32P； (2)在多组互相独立的化学反应中分别进行特定碱基的化学修饰； (3)在修饰碱基位置化学法断开DNA链； (4)聚丙烯酰胺凝胶电泳将DNA链按长短分开； (5)根据放射自显影显示区带，直接读出DNA的核苷酸序列。 化学裂解法测定DNA的核苷酸序列 Sanger法 DNA测序结果 SNP：single nucleotide polymorphism 双链DNA分子可以被上千种从微生物中分离得到的限制性内切酶（restriction enzyme）切断, 又可以被连接酶再连接起来。切断的过程不需要能量，而连接的起来的过程却需要2个分子的ATP。这就是分子克隆和重组DNA技术的基础。 大部分限制性内切酶识别的碱基序列为 6 个碱基的回文(palindrome )序列。它们在微生物细胞内扮演的却是防御外来DNA入侵的国防军的作用。如何不把自身的DNA也降解了呢？ DNA重组示意图 EcoRI与DNA的复合体 -人类基因组中重复序列的发现 DNA双螺旋结构模型，不仅与其生物功能有密切关系，还能解释DNA的重要特性--变性与复性，这对于深入了解DNA分子结构与功能的关系有重要意义。 DNA变性 (Denaturation) 1、DNA变性的概念：指DNA分子中的双螺旋结构解链为无规则线性结构的现象。 2、DNA变性的本质：维持双螺旋稳定的氢键断裂，碱基间的堆积力遭到破坏，不涉及到其一级结构的改变。 3、导致DNA变性的因素：凡能破坏双螺旋稳定性的因素，如加热、极端pH、有机试剂甲醇、乙醇、尿素及甲酰胺等，均可引起核酸分子变性。 OD260增高 粘度下降 比旋度下降 浮力密度升高 酸碱滴定曲线改变 生物活性丧失 RNA变性：从局部螺旋到线团之间的转变，RNA的变性引起的性质变化没有DNA的明显。 变性后理化性质的变化 DNA变性是在一个很窄的温度范围内发生的。通常将核酸加热变性过程中，紫外光吸收值达到最大值50%时的温度称为核酸的解链温度，由于这一现象和结晶的融解相类似，又称融解温度(Tm, melting temperature)。在Tm时，核酸分子内50%的双螺旋结构被破坏。特定核酸分子的Tm值与其G＋C所占总碱基数的百分比成正相关。 一般DNA Tm 值在85 - 90 ?C之间。 增色效应(hyperchromic effect)：指DNA变性后其紫外吸收明显增