大肠杆菌感受态的制备指导.ppt

实验二、大肠杆菌感受态的制备 一、实验原理 目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制 备，即用低渗CaCl2溶液在低温（0℃）时处理快速生长的细菌， 从而获得感受态细菌。此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此 条件下易形成抗DNA酶的羟基－钙磷酸复合物粘附在细菌表面， 通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。 在一定条件下，经过连接后的ＤＮＡ片段与感受态细胞混合保 温，可以进入感受态细胞。进入感受态细胞的ＤＮＡ分子通过复 制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性 状。将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，即可筛选出转 化体，即带有异源ＤＮＡ分子的受体细胞。 二、实验所需器材和试剂 器材： 恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作 台,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰机, 分光光度计,微 量移液枪。  试剂： 1.LB固体和液体培养基。 2.含特定抗生素的LB固体培养基。 3.100mM CaCl2溶液。 4.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。 5. 待转化质粒。  三、实验步骤 1.挑取一DH5α单菌落于5ml LB培养液中37℃过夜培养 2.取其中500ul菌液于一含50mlLB培养液的锥形瓶中，37℃振摇培养至OD600值达到0.5-0.6之间 3. 取50ml菌液置于离心管内，4 ℃ 4500g离心5分钟 4. 加入30ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液，摇荡重悬细胞，冰浴30分钟 5. 4℃ 4500g离心5分钟收集细胞后，加2 ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。 6.感受态细胞分装成200μl的小份,暂且不用的贮存于-70℃可保存半年。 取其中一份进行转化。 7. 向转化管中加入DNA（不超过10ul）,轻度摇晃混合后于冰上放置30分钟。 8. 将上述混合物转移到预热到42℃的水浴锅中，热休克90秒 (不要摇动试管)，然后将试管迅速转移到冰浴，冷却1－2分钟。 9. 向管内加入800ul的LB培养液。然后37 ℃培养45分钟。 10. 取适量体积的转化细胞转移到含有适当抗生素的LB固体平板上，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀。室温放置几分钟 11. 倒置平板于37 ℃培养12－16个小时。 四、实验注意事项 为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素： 1. 细胞生长状态和密度: 细胞生长密度以刚进入对数生长期时 为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。 2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。 3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。 4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行。 五、本实验所需要掌握内容 掌握大肠杆菌感受态的制备及转化的原理 熟悉实验的具体操作步骤，掌握无菌操作技术。 * *