大肠杆菌生长曲线指导.ppt

大肠杆菌生长曲线测定 实训目的 1．了解光电比浊计数法的原理。 2．了解细菌生长曲线的特点，绘制生长曲线。 3. 掌握光电比浊计数法测定大肠杆菌生长曲线的方法。 752型分光光度计构造原理 752型分光光度计在构造原理上是由光源室、单色器、试样室、光电管暗盒、电子系统及数字显示器等部件组成。光源除了钨卤素灯外，还有氢弧灯（或氘灯）。波长范围为200nm~850nm。 752型分光光度计能在紫外和可见光谱区域内对样品物质作定性和定量分析 . 使用方法 （1）预热仪器??将选择开关置于“T”，按下“电源”开关。 （2）选定波长??根据实验要求，转动波长手轮，调至所需要的单色波长。 （3）固定灵敏度挡?? （4）调节T=0%??轻轻旋动零旋钮，使数字显示为“00.0”，（此时试样室是打开的）。 （5）调节T=100%??将盛蒸馏水（或空白溶液，或纯溶剂）的比色皿放入比色皿座架中的第一格内 （6）吸光度的测定??将选择开关置于“A”，盖上试样室盖子，将空白液置于光路中，调节吸光度调节旋钮，使数字显示为“.000”。将盛有待测溶液的比色皿放入比色皿座架中的其它格内，盖上试样室盖，轻轻拉动试样架拉手，使待测溶液进入光路，此时数字显示值即为该待测溶液的吸光度值。读数后，打开试样室盖，切断光路。 （7）关机??实验完毕，切断电源，将比色皿取出洗净，并将比色皿座架用软纸擦净。 注重事项 （1）为了防止光电管疲惫，不测定时必须将试样室盖打开，使光路切断，以延长光电管的使用寿命。 （2）取拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，而不能碰比色皿的光学表面。 （3）比色皿不能用碱溶液或氧化性强的洗涤液洗涤，也不能用毛刷清洗。比色皿外壁附着的水或溶液应用擦镜纸或细而软的吸水纸吸干，不要擦拭，以免损伤它的光学表面。 实训材料： 1．菌种 大肠埃希菌（E.coli）1~18h液体培养物。 2．培养基 营养肉汤培养基，生理盐水 3．其它：721型光电比色计、1ml无菌移液管、摇床等。 原 理 细菌的生长一般指群体的生长，常常具有一定的规律性。描述细菌在液体培养基中的生长规律的曲线叫做生长曲线，即将一定量的细菌接种到一定容积的液体培养基中，在适宜的条件下进行培养，以培养时间为横坐标，以菌数的对数为纵坐标进行作图得到的曲线。 典型的生长曲线可分为延迟期、对数生长期、稳定期和衰亡期四个时期。 细菌培养物在生长过程中，由于原生质含量的增加，会引起培养物混浊度的增高。细菌悬液的混浊度和透光度成反比、与光密度成正比，透光度或光密度可借助光电比浊计精确测出，因此可用光电比浊计测定细胞悬液的光密度（OD值），表示该菌在特定实验条件下的细菌相对数目，进而反映出其相对生长量。 方法和步骤 1．接种、培养 采用无菌操作技术用移液管向每个100ml营养肉汤培养基的三角瓶中试管准确加入大肠埃希菌悬液3ml，轻轻振荡混匀，另设一空白对照组（不加大肠埃希菌悬液）。 将接种后的9组三角瓶置于摇床上，37℃,220r/min，振荡培养。间隔一定时间，即0、1、2、3、4、5、6、7、8、9~18小时后，从摇床上将取下其中一瓶三角瓶培养物（标记时间），置4℃冰箱保存。 2．比浊测定 每组取9支干净小试管，从不同时间培养菌液中摇匀各取3ml，将大肠埃希菌培养液进行适当稀释，使光密度在0.1~0.65之间，以没有接种的空白对照组液体培养基调零点，在600nm波长，1cm比色杯中依次进行测定OD值。测定从最稀浓度的菌悬液开始，依次测定。 经稀释后测定的OD值要乘以稀释倍数，才是培养液的实际OD值。 3．绘制生长曲线 以光密度(OD值)为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制大肠埃希菌的生长曲线。 注意事项：测定OD值前，将待测的培养液振荡，使细胞均匀分布。测定OD值后，将比色杯的菌液倾入容器中，用水冲洗比色杯，冲洗水也收集于容器中进行灭菌，最后用75%酒精冲洗比色杯。 思考题：分析你所绘制大肠杆菌生长曲线的特点？为什么？ 水中细菌总数的检测 2人/组 准备 营养琼脂120ml，生理盐水100ml(0.9gNaCl) 平皿7套，试管2支，1ml移液管4支，10ml移液管2支 预习课本260页