新一代基因测序技术讲述.ppt

新一代基因测序技术原理及其在医学中的应用 新一代基因测序技术(Next Generation Sequencing Technologies)是一系列在2004年后问世的新的DNA测序技术。这些新技术使用不同以往的化学测序法，依靠高度并行的基因序列读取方式，取得了令人难以置信的DNA测序高通量。新一代基因测序技术能在数天内完成第一代基因测序技术花费1O年完成的人类基因组测序。 自2004年问世起，不断发展的新一代基因测序技术（NGS）在生物医学领域引发了许多突破性的发现，推动了基因组学的革命，促进新学科的创立，如个人基因组学，细菌基因组流行病学。 基因测序技术起源与发展 新一代基因测序技术平台简介 新一代基因测序技术的临床应用 肿瘤分子诊断领域 肿瘤研究领域 遗传病筛查领域 传染病研究领域 细菌基因组流行病领域 基因测序技术起源与发展 20世纪70年代初期，分别在几个独立的实验室，以不同的方法实现了基因测序 直到1977年，可靠的基因测序方法——Sanger测序法和Maxam—Gilbert测序法才问世 Sanger测序法因为其试剂高效低毒，因而得到不断的改善，进一步发展成依靠染色的自动化分析基因测序法 2001年，完成了第一个人类基因组序列图谱。该基因组序列图谱不仅可以帮助快速识别单个基因，而且为探索研究人类基因组的主要区域提供了便利 Sanger测序法的局限性 对常规DNA测序来说太昂贵，太耗时。随着各种动植物基因组数据的大量产生，科学家开始专注于基因的个体多样性，并尝试用新 的方法来描述个体的基因组 由于成本和测序数据输出量的限制，用Sanger测序法获取不同个体的基因组进行大规模的对比研究是不可行的 从2004年起，一系列新的DNA测序技术，名为“新一代基因测序技术”， 不断得到开发，在生物医学领域引发了许多突破性的发现，并彻底改变了基因组测序领域的发展 自动化Sanger方法被认为是“第一代”基因测序技术 “新一代基因测序技术” (Next Generation Sequencing Technologies，NGS) 相对Sanger法，新一代基因测序技术的主要优点是能够快速，低价地提供巨量的基因序列数据。它们每次测序运行能读取的碱基数高达百亿。 可以代替生物晶片去对基因定性、定量分析。 可以快速测序全基因组，大规模对比研究不同个体的基因组成为可能； 2004年起开始面世的一系列新的DNA测序技术有统一的名称—— “新一代基因测序技术”。事实上各种新一代基因测序技术的化学测序方法有着显著的不同，但是有3个共同特征 ： 1. 新一代基因测序技术都能够同时处理以百万计的基因序列读取，这也是它们能高通量地测序基因的原因。 2. 新一代基因测序技术通过PCR扩增创建它们的基因序列读取片段库，劳动强度大大低于传统的使用载体克隆的Sanger测序。 3. 与自动化Sanger测序技术相比，新一代基因测序技术所产生的读长都比较短(35—700碱基)。 NGS技术平台简介 Roche(454)GS FLX基因测序技术 首先对目标DNA的酶切短链进行油包水PCR扩增，然后以扩增的DNA酶切短链为模版来合成新的DNA。当对应的三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)被加入到新合成的DNA链上时，添加的荧光素酶能产生光。根据闪光次序以及对应加入的dNTP，测序仪所携带的软件就可以创建目标DNA模板的具体序列信息。 Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见的DNA碱基序列。 诺贝尔奖得主Frederick Sanger和Walter Gilbert Illumina的Genome Analyzer测序技术 对目标DNA的酶切短链进行扩增是通过桥式PCR来完成的。经过PCR扩增后，芯片上的目标DNA片段簇被用来做为模版来合成新的DNA链，四个差异化标记的荧光dNTP为每个目标DNA片段簇的复制提供原料。一旦单个dNTP被加入新合成DNA的末端，此dNTP的差异化标记荧光就会被读取并记录，由此实现边合成边测序。当DNA延伸步骤完成，测序仪所携带的电脑软件程序就会分析每个目标DNA簇的序列，并完成各个短链序列的对齐，以及目标基因组的组合 。 近年来，Illumina公司在基因测序仪行业一直占据主导地位，其产品占据60％市场份额。2010年推出的IlluminaG