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小麦硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性测定 摘要：硝酸还原酶(NrtiateRdeucasteNR)是植物体内重要的诱导酶,影响农作物的总氮和蛋白氮水平,与作物的耐肥性有密切关系,在植物基因表达蛋白质分子基础研究和植物氮代谢途径及调控研究中也占有十分重要的地位谷氨酞胺合成酶(GS)是参与氨同化过程的关键酶。硝酸还原酶活性和谷氨酞胺合成酶活性是和小麦高产高蛋白含量与高氮效率密切相关的复杂的数量性状,因此,对小麦硝酸还原酶活性和谷氨酞胺合成酶活性的研究对高产高蛋白含量与高氮效率小麦新品种的选育具有重要意义。小麦籽粒蛋白质含量与氮代谢密切相关。许多研究表明硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶是氮素同化的关键酶。为了明确植物体内硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶的活性，本实验通过测定小麦的硝酸还原酶和谷氨酰胺合成酶活性硝酸还原酶谷氨酰胺合成酶活性测定1 实验材料、试剂与设备 1.1 实验原材料 用50mmol/L KNO3溶液处理好的新鲜小麦 1.2 实验试剂 1.2.1 硝酸还原酶活性测定的试剂 亚硝酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、对氨基苯磺酸、浓盐酸、萘基乙烯胺、硝酸钾、三氯乙酸 1、反应液（0.1mol/LpH=7.5的磷酸钾—磷酸缓冲液）：2.527g溶解于0.1mol/LpH=7.5的磷酸缓冲液中，定容到250ml。0.1mol/LpH=7.5的磷酸缓冲液：30.0905gNa2HPO4用蒸馏水溶解以后，定容到1000ml。 2、终止液：30gTCA溶解于70gH2O中。 3、显色液（1%硫胺溶液和0.02%α-萘胺溶液）1%硫胺溶液：1.000g对氨基苯磺酸溶解于99ml 3.0mol/L的盐酸溶液中。0.02%α-萘胺溶液：0.0200gα-萘胺用蒸馏水溶解以后，定容至100ml，储藏于棕色瓶中。 4、亚硝态氮标准溶液：精准称取分析纯NaNO2 0.9857g溶于蒸馏水中，定容至1000ml，然后从中吸取5ml再定容至1000ml，此溶液即为含亚硝态氮1μg/ml的标准溶液。 1.2.2 谷氨酰胺合成酶活性测定的试剂三羟甲基氨基甲烷、硫酸镁、二硫苏糖醇、蔗糖、浓盐酸、谷氨酸钠盐、半胱氨酸、乙二酸双（氨乙基醚）四乙酸（EGTA）、盐酸羟胺、氯化铁、三氯乙酸、三磷酸腺苷（ATP）1、酶液提取液：称取1.5295gTris、0.1245gMgSO4、0.1543gDTT和34.2500g蔗糖，溶于蒸馏水中，用盐酸调制pH=8.0，定容至250ml，放入冰箱中预冷。2、反应液（反应混合液A和反应混合液B） 反应混合液A：称取3.0590g Tris、4.9795gMgSO4、0.8628g谷氨酸钠盐、0.6057g半胱氨酸和0.1920gEGTA，溶于蒸馏水中，用盐酸调制pH=7.4，定容至250ml。 反应混合液B：称取3.0590g Tris、4.9795gMgSO4、0.8628g谷氨酸钠盐、0.6057g半胱氨酸、0.1920gEGTA和1.3898g盐酸羟胺，溶于蒸馏水中，用盐酸调制pH=7.4，定容至250ml。 3、显色液：称取3.3176gTCA和10.1021gFeCL3溶于蒸馏水中，加5ml浓盐酸，定容至100ml。 4、ATP溶液：称取2.4210gNa2ATP溶于100ml蒸馏水中（临用前配制）。 1.3 实验设备 台式离心机 分光光度计 水浴锅 真空干燥箱 照光设备 2 实验原理硝酸还原酶是植物氮素同化的关键酶，它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐，产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸及α--萘胺在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物。此红色偶氮化合物在540nm下有最大吸收峰，可用分光光度计测定。故硝酸还原酶活性可以由产生的亚硝态氮的量表示，而亚硝态氮的量可以由标准曲线查[3,4]得。硝酸还原酶活性的测定可采用活体法和离体法。活体法步骤简单，适合快速、多组测定；离体法复杂，但重复性较好。本次实验采用活体法。 谷氨酰胺合成酶是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP和Mg﹢存在下它能催化植物体内在硝酸还原过程中氨与谷氨酸形成谷氨酰胺，实现氨的同化。在生物体内，谷氨酰胺既是氨的储存形式（消除氨毒），又可用于谷氨酸的合成，再进一步合成其他氨基酸。但在该实验设计反应体系中，谷氨酰胺与盐酸羟胺等物质发生反应，生成γ-谷氨酰基异羟肟酸。此物质在酸性条件下可与Fe3﹢形成红色的络合物，该络合物在540nm处有最大的吸收峰，可用分光光度计测定[5]。 因此，谷氨酰胺合成酶的活性可以用产生的γ-谷氨酰基异羟肟酸与Fe3﹢形成红色的络合物的量来表示，一般间接的用540nm处吸光值的大小来表示，单位为A*mg-1(protein)*h-1。3 实验方法 3.1 硝酸还原酶活性测定的实验步骤 3.1.1 标准曲线的绘制 取7支试管，按