实验报2告(终极修改版再改).docx

生物化学实验报告玉米中SOD的分离提取及性质研究崔洪源1，王旭1，戴琦泽1，范立峰1（1.合肥工业大学 生物与食品工程学院，安徽 合肥 230009）摘 要：本组实验计划从玉米中提取出SOD，并研究其在抗氧化作用中的性质，确定其同工酶类型。本实验从玉米中提取SOD，并且引用邻苯三酚自氧化方法测定其活力的方法研究其性质，通过计算求出SOD的活性，并通过PAGE定位染色法鉴定同工酶的类型。关键词：玉米；SOD提取；酶活性；同工酶类型1 前言SOD广泛存在于生物界，是防御氧毒害的关键酶。SOD主要有CuZn-、Mn-、Fe-SOD三种类型同工酶，它们共同的生物学作用是专一地清除生物氧化中产生的超氧阴离子自由基（对细胞组分及细胞器，尤其是生物膜有严重的损伤作用），具有抗衰老、抗辐射、抗癌等生理作用。在医药中，SOD可用于治疗辐射病、自身免疫性疾病、炎症等；在食品中，可用于保健食品添加剂；在化妆品中，可防止皮肤衰老、抗炎、防晒等作用。植物中大蒜的SOD含量丰富，所以，本实验研究大蒜中SOD的性质，并确定SOD同工酶类型。1.1 SOD的性质超氧化物歧化酶(superoxide dismutase)简称SOD，是一种生物活性蛋白质，是人体不可缺少、重要的氧自由清除剂，也是目前为止发现的唯一的以自由基为底物的酶。SOD金属蛋白酶，对pH、热和蛋白酶水解等反应比一般酶稳定。它广泛存在于各类生物体内，按其所含金属离子的不同，可分为3种：铜锌超氧化物歧化酶(Cu·Zn—SOD)、锰超氧化物歧化酶(Mn—SOD)和铁超氧化物歧化酶(Fe—SOD)。1.2 SOD催化如本实验中SOD取自大蒜，并且引用邻苯三酚自氧化方法测定其活力的方法。邻苯三酚在碱性条件下能迅速自氧化释放出O2-·，生成带色的中间产物。反应开始后，反应液先变成黄棕色，几分钟后变成绿色，几小时后又变成黄色，这是生成中间产物不断氧化的结果。这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段，中间物的积累在滞留30-45S后与时间成线性关系，一般时间维持在4min内，中间物在420nm波长处有强烈的光吸收。当有SOD存在时，由于他能催化O2-·与H+结合生成O2和H2O2,从而阻止了中间产物的积累。因此，通过计算即可求出SOD的活性。1.3 酶活力单位定义在25℃恒温条件下每毫升反应液中每分钟抑制邻苯三氛自氧化率达50%的酶量定义为一个酶活力单位。2 试剂与器材2.1 试剂 1、PH7.80.05mol/l磷酸盐缓冲溶液（参照表1） 2、氯仿-无水乙醇混合液，以3：5体积比混合 3、PH8.2 50mmol/l Tris-HCL （参照表2）4、10mmol/l HCL ,SOD样液； 5、50mmol/l邻苯三氛 称取邻苯三氛0.063g,用10mmol/lHCL溶液溶解定容至10ml,避光保存。 6、2.45×10-3mol/l氮蓝四唑NBT:称200mgNBT使其溶于去离子水中并定容至100ml，置棕色试剂瓶中，避光4℃保存。由于NBT溶液用量较多，且NBT价格贵，每次使用后妥善保存，可反复使用多次。当黄色NBT溶液颜色变浅或变绿并出现沉淀时则不能继续使用，应重新配制。 7、3.6×10-2mol/l PH7.8磷酸钠缓冲溶液，内含2ml8×10 -2 mol/l四甲基乙二胺(TEMED)、2ml8×10-5 mol/l核黄素。在100ml3.6×10-2mol/l PH7.8磷酸钠缓冲溶液（配制参考表1）中含0.42mlTEMED及1.32mg核黄素。至棕色瓶中4℃保存。 8、冷丙酮、30%双氧水、40%蔗糖溶液（内含0.1%溴酚蓝）、Tris、TEMED、Acr、Bis、核黄素。2.2 实验仪器移液管、离心机5000r/min,量筒、烧杯、研钵、玻璃棒、微量移液器、试管、分光光度计、1cm比色皿、恒温水浴槽、电泳槽、电泳仪、培养皿、4*108日光灯、容量瓶、烧杯、冰箱等。表1PH0.2mol/L Na2HPO4(ml)0.2mol/L NaH2PO4(ml)5.88.092.06.012.387.76.218.581.56.426.573.56.637.562.56.849.051.07.061.039.07.272.028.07.481.019.07.687.013.07.891.58.58.094.75.3表2Tris-HCL缓冲溶液（0.05mol/l，25°C）50ml 0.1mol/L Tris溶液和Xml 0.1mol/L HCL混匀后，加水稀释到100mlPHX/mlPHX/mlPHX/ml7.145.77.834.58.514.77.244.77.932.08.612.47.343.48.029.28.710.37.442.08.126.28.8