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绿原酸标准曲线的绘制 一、实验目的 1.1 熟练掌握用高效液相色谱仪测绿原酸含量的方法，绘制标准曲线； 1.2 熟练掌握用紫外分光光度仪测绿原酸含量的方法，绘制标准曲线； 二、原理 2.1 绿原酸简介 绿原酸(chlorogenic acid)是由咖啡酸(caffeic acid)与奎尼酸(鸡纳酸,quinic acid,即1-羟基六氢没食子酸)组成的缩酚酸,异名咖啡鞣酸,化学名3-O-咖啡酰奎尼酸(3-O-caf-feoylquinic acid),分子式:C16H18O9,分子量:345.30，是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物。 2.2 高效液相色谱仪的工作原理： 高效液相色谱仪的系统由储液器、泵、进样器、色谱柱、检测器、记录仪等几部分组成。储液器中的流动相被高压泵打入系统,样品溶液经进样器进入流动相,被流动相载入色谱柱(固定相) 内, 由于样品溶液中的各组分在两相中具有不同的分配系数, 在两相中作相对运动时, 经过反复多次的吸附- 解吸的分配过程, 各组分在移动速度上产生较大的差别, 被分离成单个组分依次从柱内流出, 通过检测器时, 样品浓度被转换成电信号传送到记录仪,数据以图谱形式打印出来。 三、试剂与仪器 3.1 材料与试剂：绿原酸标准品；乙腈为色谱纯试剂，磷酸、甲醇、乙醇等试剂均为分析纯； 3.2 主要仪器：高效液相色谱仪，分析天平，25ml、50ml棕色容量瓶，滴定管，10ml,25ml,50ml,100ml容量瓶各7个，1ml、2ml、5ml的移液管，紫外分光光度仪，比色皿；擦镜纸；注射器。 四、实验步骤 4.1 用紫外分光光度法所测的绿原酸标准曲线 紫外分光光度法：精密称取绿原酸标准品0.0055g，用80%的乙醇溶解，转移到100ml容量瓶中，加80%乙醇到刻度，混匀，制得标准母液。精密吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0ml于25ml容量瓶中，加80%乙醇到刻度，混匀，此为标准系列溶液。将标准溶液在200～400nm波长范围内扫描，测定绿原酸的最大吸收波长，在最大波长处测定吸光度。以绿原酸标准品的浓度为横坐标，以其吸光度为纵坐标绘制标准曲线，求出相应的回归方程。 4.2 用高效液相色谱仪所测的绿原酸标准曲线 高效液相色谱法(本方法参照《中国药典( 2005 版) 》) 。色谱柱: C18ODS(250 mm ×4. 6 mm, 5μm) ;流动相:乙腈20. 4%磷酸溶液(13z 87) ;检测波长为327 nm;柱温: 20℃;进样量: 10μL。标准曲线制备:准确称取绿原酸对照品20 mg,置50 mL棕色容量瓶中,加60%甲醇适量,超声溶解并稀释至刻度,摇匀,分别准确移取1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL,置25 mL棕色容量瓶中,用60%甲醇溶解并稀释至刻度,得一系列绿原酸标准溶液,按上述色谱条件,进样10 μL, 测定峰面积, 以峰面积积分值(Y)为纵坐标、绿原酸含量(X)为横坐标绘制标准工作曲线,计算并得回归方程。 五．结果与讨论 5.1用紫外分光光度法所测的绿原酸标准曲线 5.1.1绿原酸标准品的波长扫描 绿原酸标准品的波长扫描如下图所示，可知绿原酸的最大波长为328nm。 5.1.2由定量测量所得的绿原酸的浓度和吸光度的关系 如下表所示： 浓度ug/ml 4.4 6.6 8.8 11 13.2 15.4 17.6 19.8 22 吸光度A 0.2217 0.3155 0.4136 0.4983 0.6135 0.7221 0.8239 0.9086 1.0362 由此可绘制绿原酸标准曲线，如下图所示： 以杜仲绿原酸标准溶液的浓度和吸光度进行线性回归，得回归方程y=0.0461x+0.0089,R2=0.9987。表明绿原酸含量在4.4-22ug/ml范围内与吸光度线性关系良好。 4.2 用高效液相色谱仪所测的绿原酸标准曲线 4.2.1 测量所得的绿原酸的浓度和锋面积的关系 如下表2所示： 浓度ug/ml 16 32 48 64 80 96 112 峰面积m2 207389 698949 1139087 1610034 2168360 2762896 3227387 表2 绿原酸的浓度和锋面积的关系 4.2.2 绿原酸标准品的色谱图 图3 绿原酸标准品的色谱图 4.2.3绘制绿原酸标准曲线 如下图4所示： 图4 绿原酸标准曲线 以杜仲绿原酸标准溶液的浓度和峰面积进行线性回归，得回归方程y=31742x-337890,R2=0.9986。表明绿原酸含量在16-112ug/ml范围内与峰面积线性关系良好。 六. 总结 通过紫外分