实验五-多抗制备4免疫比浊.pptVIP

沉淀反应 微生物与免疫教研室 本次实验内容 实验一、双向免疫扩散试验 ——LDL多抗鉴定及效价测定 实验二、免疫浊度测定 ——免疫球蛋白检测 一、本次实验的目的： 1、掌握可溶性抗原制备抗血清鉴定的常用方法。 2、掌握双向免疫扩散试验方法。 3、掌握抗体效价的判断。 4、掌握免疫浊度的测定原理。 5、熟悉免疫球蛋白检测的临床意义。 沉淀反应（precipitation） 可溶性抗原与相应抗体在适当条件下发生特异性结合所出现的沉淀现象。 分类 思考：抗原抗体反应的四大特点？ 特异性 可逆性 比例性 阶段性 沉淀反应的特点 抗原为可溶性物质，如蛋白质、多糖 沉淀反应分两个阶段： 第一阶段、抗原抗体特异性结合(不可见) 第二阶段、形成可见的免疫复合物（可见） 条件 电解质，温度，酸碱度 凝胶内沉淀试验(gel phase precipitation) 主要是指琼脂糖扩散或称凝胶扩散(gel diffusion)。常用的凝胶有琼脂、琼脂糖、葡聚糖或聚丙稀酰胺凝胶等。 一、单向免疫扩散试验 (一) 原理 将一定量的抗体混入琼脂凝胶中，使待测的抗原物质在凝胶中自由扩散，与抗体结合形成沉淀环，沉淀环的大小与抗原浓度呈正相关。 (二) 操作步骤（平板法） 1.将抗体和0.9%琼脂糖50-56℃混合,即刻倾注成平板。 2.待凝固后在琼脂板上打孔,孔中加入已稀释的抗原溶液和不同浓度的抗原标准品溶液。 3.置37℃,让其向四周自由扩散,24-48h后可见其孔周围出现沉淀环。 (三) 方法评价 单向琼脂扩散试验是一种稳定、简便、毋需特殊设备，一般实验室均可使用的常规方法，试验的重复性和线性均好。敏感度为1.25mg/L (四) 影响因素 1. 抗原分子量 抗原分子量大，扩散慢，沉淀环较小；抗原分子量小，扩散快，沉淀环相对较大。要求待检血清和抗原标准品在血清学上具有均一性，否则可能出现结果偏高或偏低。 2. 抗体种类 实验证明兔抗血清优于马、羊抗血清，兔抗血清可测抗原0.1~1IU/ml，马抗血清为1~10IU/ml，羊为0.4~4IU/ml，为提高实验敏感度，应首选敏感度高的抗血清。 二、双向琼脂扩散试验 (一) 原理 将可溶性抗原和抗体置于琼脂凝胶板的对应孔中，两者各自在凝胶中向四周自由扩散，当抗原与抗体相遇，在比例合适时形成可见的白色沉淀线。沉淀线的特征与抗原抗体的浓度、纯度和扩散速率等有关。 (二) 操作步骤（平板法） 融化琼脂，浇板 每张载玻片约4ml。 凝固，打孔 孔径3mm，孔间距3~5mm，孔型有双孔型、三角孔型、双排孔型和梅花孔型。 加样 在相对孔内加抗原或抗体。 孵育 使抗原抗体自由扩散，在两孔之间抗原抗体相遇，在比例适时形成可见的沉淀线。沉淀线的数目、形态和位置与抗原和抗体的纯度、浓度和扩散速度有关。 (三) 双向免疫扩散试验的应用 1. 检测未知抗原或抗体及其相对含量 将已知的抗体或抗原与待检标本加入成对孔中 根据沉淀线有无定性； 根据沉淀线的位置估计抗原或抗体的相对含量 根据沉淀弧形状判断抗原或抗体的相对扩散速率。 2. 抗原性质分析 利用三角孔型，将待检抗原和标准抗原加入相邻两个孔中，与另一孔相对，根据沉淀线形状分析待测抗原，见图 。 3. 抗体效价滴定 用梅花型孔，中间放抗原，周围孔放下不同稀释度的相应抗体，以出现沉淀线的最高稀释倍数为该抗体的效价。 4. 抗体或抗原纯度鉴定 用混合抗原或抗体鉴定抗体或抗原，出现一条沉淀线说明待测抗原或抗体纯，出现多条说明不纯。 双扩散试验优缺点 优点：简单易行，用途广泛 缺点：技术灵敏度低，出现结果慢，不能精确定量。 经典的沉淀试验有4个缺点无法克服： 操作繁琐 敏感度低（10～100μg/ml） 时间长 难以自动化 免疫浊度测定（一）基本原理： 免疫浊度测定的基本原理是：抗原抗体在特殊缓冲液中快速形成抗原抗体复合物，使反应液出现浊度。当反应液中保持抗体过量且固定时，形