核酸分子杂交技术讲述.ppt

二、影响杂交的因素 1、核酸分子的浓度和长度： 浓度越大，复性速度越快 分子越大，复性速度越慢 单链探针，浓度增加，杂交效率增加 双链探针，浓度控制在0.1~0.5μg,浓度过高影响杂 交效率 2、温度： （1）DNA/DNA杂交，适宜温度较Tm值低20~25℃ （2）RNA/DNA或RNA/RNA杂交，加甲酰胺降低 Tm值 （3）用寡核苷酸探针杂交，适宜温度较Tm值低5℃ 3、离子强度： （1）低盐浓度时杂交率较低，随着盐浓度增加，杂交率增加 （2）高浓度的盐使碱基错配的杂交体更稳定，当进行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交反应液中较高的盐浓度和洗膜溶液的盐浓度 4、甲酰胺： （1）甲酰胺能降低核酸杂交的Tm值，能降低杂交液的温度，低温时探针与待测核酸杂交更稳定，当待测核酸与探针同源性不高时，加50%甲酰胺溶液在35~42 ℃杂交 （2）如待测核酸序列与探针同源性高时，则用水溶液在68℃杂交 5、核酸分子的复杂性： （1）核酸的复杂性是指存在于反应体系中不同顺序的总长度 （2）Cot?与反应体系中核酸复杂性成正比 （3）两个DNA样品浓度绝对一致时，变性后的相对杂交率取决于DNA的相对复杂性 6、非特异性杂交反应： （1）杂交前封闭非特异性杂交位点，减少其对探针的非特异性吸附 （2）常用的封闭物有两类：即非特异性DNA和高分子化合物。如鲑精DNA或小牛胸腺DNA，Denharts溶液或脱脂奶粉 三、 核酸分子杂交的方法 按待测核酸是否固定在固相支持物上分： 固-液相杂交 膜上印迹杂交 原位杂交 液相杂交 RNA酶保护分析法 核酸酶S1保护分析法 带有DNA片段的凝胶 DNA分子 限制片段 限制性酶切割 琼脂糖电泳 至膜（尼龙膜或硝酸纤维素滤膜）上 转膜 杂交、显影 凝胶 滤膜 用缓冲液转移DNA 吸附有DNA片段的膜 Southern 印迹杂交的技术流程 （一）Southern印迹杂交 1、待测核酸样品的制备 （1）裂解或破碎细胞 （2）抽取纯化基因组DNA （3）限制酶消化DNA为大小不同的DNA片段 2、待测DNA样品的电泳分离 （1）琼脂糖浓度：分离大片段用低浓度胶 分离小片段用高浓度胶 （ 2）凝胶电泳：凝胶具有分子筛效应，大分子 DNA泳动慢,小分子DNA泳动快， 大小 相同的分子处于同一条带 （ 3）分子量标准：经HindⅢ消化的λDNA，杂所用分子量标准可用核素标记 3、凝胶中核酸的变性（碱变化） 凝胶置于NaOH溶液中使DNA变性断裂为较短的 单链 DNA,中性缓冲液中和凝胶中的缓冲液 4、Southern印迹 指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固 相支持物上的过程。 （1）固相支持物的选择 理想的固相支持物应具备的特性： ①具有较强结合核酸分子的能力 ②不影响与探针的杂交反应 ③与核酸分子结合稳定牢固 ④具有良好的机械性能 ?非特异吸附少 常用的固相支持物 ①硝酸纤维素膜：优点是吸附能力强，杂交信号本 底低。缺点是DNA分子结合不牢固 ②尼龙膜：优点是结合单链，双链DNA的能力比硝酸 纤维素膜强；缺点：杂交信号本底高 ③化学活化膜：优点：DNA与膜共价结合；对不同 大小的DNA片段有同等结合能力；缺点：结合能 力较上述两种膜低 Southern印迹的常用方法 （1）毛细管虹吸印迹法 利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。 其基本原理是：容器中的转移缓冲液含有高浓度的NaCl和柠檬酸钠，上层吸水纸的虹吸作用使缓冲液通过滤纸桥、滤纸、凝胶、硝酸纤维素滤膜向上运动，同时带动凝胶中的DNA片段垂直向上运动，凝胶中的DNA片段移出凝胶而滞留在膜上 分子生物学检测技术 核