多重实时PCR分析方法的开发.PDFVIP

ww w.a glyc o.c om 北京艾德豪克国际技术有限公司 王美权 翻译 1 1 / 10 一种用于肝素质量监管的、检测原料药中反刍 DNA 的 多重实时 PCR 分析方法的开发 草案 Sharla M. Peters1, Yolanda L. Jones1, Frank Perrella2, Tai Ha3, and Haile F. Yancy1 1 美国食品及药物管理局动物医学中心研究办公室（U. S. Food and Drug Administration, Center for Veterinary Medicine, Office of Research）, 8401 Muirkirk Road, Laurel, Maryland 20708, USA。2 美国食品及药物管理局药物评价及研 究中心检定办公室（U.S. Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research, Office of Compliance）, Silver Spring, MD 20993, USA。3 内布拉斯加 州农业部（Nebraska Department of Agriculture）, 301 Centennial Mall South, Lincoln, Nebraska 68508, USA。 摘要 我们开发出了一种检测猪源粗品肝素产品中反刍原料的实时 PCR 分析方法。此方法包括 鉴别反刍（牛，绵羊，山羊）和猪原料的冻干态的引物和探针组合，还包括一个扩增内标。 此方法已为两位分析人员所验证：第一位供职于 FDA，第二位供职于一个独立的州实验室。 此方法利用美国 FDA 动物医学中心研究办公室开发的最严格的验收标准进行了评估。此 种用于检测粗品猪肝素中反刍 DNA 的肝素多重实时分析方法（heparin Multiplex Real- Time Assay, 简称 hMRTA）通过了专属性（specificity）、灵敏度（sensitivity）和选择 性（selectivity）方面的最严格的验收标准。此方法满足了先前通过用于检测食物中反刍 动物原料的多重实时 PCR 分析方法（MRTA）所确立的灵敏度和重现性要求。hMRTA 方 法应用于粗品猪肝素时，表现出了 98%的灵敏度（符合次数）、98%的真阳性和 2%的假 阴性。此多重 PCR 分析方法可检测三种反刍物种，验证猪源性，并能用作检查工具或作 为确证方法。它也能为粗品猪肝素的质量提供额外保证，并将有助于对肝素供应的物种来 源进行鉴别和控制。粗品肝素动物来源的控制对确保含肝素药物和设备的安全以及保护公 众健康至关重要。 ww w.a glyc o.c om 北京艾德豪克国际技术有限公司 王美权 翻译 2 2 / 10 引言 FDA 的行业指导意见草案《药物及医疗设备用途肝素：粗品肝素质量监管（Heparin for Drug and Medical Device Use: Monitoring Crude Heparin for Quality）》就粗品肝 素污染的可能风险对活性药物成分（APIs）制造商、药物和医疗设备的成品制造商、分装 商及其他相关方进行了警告。 该指导意见草案提供了数个推荐项目，它们将帮助 API 制造商、药物及医疗设备的成品制 造商、分装商及其他相关方更好地控制可能含有过硫酸软骨素（oversulfated chondroitin sulfate，简称 OSCS）或非猪原料（特别是反刍原料）污染的粗品肝素的使 用。其中，该指导意见草案推荐，接收和使用粗品肝素以制造含肝素的药物和医疗设备的 药物或医疗设备制造商，在制造或制备含肝素的药物或医疗设备前，应检测并确认每批粗 品肝素的动物来源。检测方法应当通过资格认证，才能用之检测粗品肝素以验证来源物种。 方法应当基于良好的科学原则（例如，足够的准确性和专属性）并具有一定程度的、与当 前科学知识状况和风险相称的灵敏性。下述方法是一种测量粗品肝素中反刍污染物的分析 方法，它使用了实时聚合酶链反应（PCR，hMRTA）。此方法已使用猪源粗品肝素和牛 参照物进行了适应性评估。此方法可用于鉴别猪源粗品肝素中的反刍 DNA。本方案将提 供检测粗品猪肝素中反刍原料所执行的实时 PCR 分析方法的方法、试剂和设备方面的详 情。合适的替代方法或方法组合也可进行资格验证，以用之检查粗品肝素中的反刍原料。 材料和方法 1. DNA 提取 引言： 下面是从 0.5 mL 干燥的粗品肝素中分离 DNA 的说明。开始扩增步骤前请完整地阅读此 份 SOP（标准