临床基因扩增检验标本的处理、保存和核酸提取方法及质量控制3综述.ppt

临床标本中PCR反应抑制物 内源性的 :免疫球蛋白、蛋白酶、血红素及其代谢产物、白细胞内的乳铁蛋白、肌红蛋白、脂类、粘蛋白、尿素、离子、胆盐、多糖等。 外源性的 :如肝素抗凝剂、纤维素和硝酸纤维素、过度UV照射后的矿物油、手套滑石粉、标本容器或采样器材上含有的抑制物。 注意事项 肝素的作用机理 肝素对MLV逆转录酶和TAQ DNA聚合酶均很强的抑制作用，如果临床标本为肝素抗凝，则在核酸纯化过程中，标本中的肝素可结合于DNA和RNA上，尽管肝素和核酸本身都带正电荷。 对标本进行煮沸、凝胶过滤、酸碱处理后凝胶过滤、反复乙醇沉淀等均不能去除肝素的这种干扰作用。 每μg核酸标本中加入0.1U的肝素,即可100%的抑制酶活性。 在标本中加入肝素酶I 或Ⅱ1~3 U/μg核酸(于5 mM Tris pH7.5, 1 mM CaCl2, 40 U RNasin 25 ℃2小时) 可去除肝素的抑制作用。 血红蛋白、乳铁蛋白（lactoferrin） 血红蛋白和乳铁蛋白分别是红细胞和白细胞内的主要PCR抑制物,它们均含有铁。 抑制机制可能是： 1）与这些蛋白释放铁离子至PCR混合物中有关。研究铁的抑制效应时，发现其干扰DNA合成，而且胆红素、胆盐和氯化高铁血红素（Hemin）等血红蛋白衍生物，也是PCR抑制物。 2）亚铁血红素(Heme)可通过返馈抑制调节DNA聚合酶活性及协调红细胞内血红蛋白成分的合成。也观察到，氯化高铁血红素通过直接作用于DNA聚合酶，与成为一个与靶DNA竞争的抑制剂和核苷酸的非竞争性抑制剂 。 3）由于靶核酸DNA被血液中大量的凝血有机物质包裹所致，使得靶DNA不能接触DNA聚合酶。 血红蛋白 1%(V/V)血液可完全抑制Taq酶活性，与Mg2+浓度无关。Tth聚合酶在含4%（V/V）血液的PCR反应混合液中可以进行扩增，加入1U单链DNA结合蛋白——T4基因32蛋白(gp32)，Tth聚合酶在含8%（V/V）血液情况下，仍可扩增。因此，使用Tth聚合酶和gp32蛋白，可实现从临床标本不提取纯化核酸直接扩增靶DNA。 不同的热稳定的DNA聚合酶对临床标本中的抑制物的敏感性不一样 。 IgG IgG的抑制作用是由于其与单链DNA的相互作用，使得靶DNA不能与DNA聚合酶相互作用 使用煮沸作为标本处理方法或使用PCR前的热启动,将增强IgG对PCR反应的抑制 去除或减轻抑制的一些方法 NaOH处理可中和临床标本中的Taq DNA聚合酶抑制剂，但这种方法不适用于DNA含量低的标本，因为NaOH处理可使DNA大量丢失。 去除或减轻抑制的一些方法 加入0.6% (wt/vol)牛血清白蛋白（BSA）可降低血液对Taq DNA聚合酶的抑制效应，既使在2%（vol/vol）血液存在下亦可成功扩增，而通常血液含量只能是0.2%。 BSA也可增加rTth或Taq DNA聚合酶的扩增能力，使其对粪便和肉类标本中抑制物的抵抗能力分别提高10和20倍。 单链DNA结合T4基因32蛋白（gp32）有类似BSA的增强效应。 核酸纯化 核酸分离纯化技术起源于二十世纪五十年代，在七十年代和八十年代中传统的核酸沉淀溶解分离纯化方法得到了普遍的应用和推广。 传统的核酸提取方法常涉及去垢剂裂解、蛋白酶处理、有机溶剂提取及乙醇沉淀等步骤。 提取核酸的质量 纯化的靶核酸的完整性：可使用凝胶电泳将样本的核酸提取物与一核酸标准比较测定。 核酸提取的产率：可在A260读数测定。 核酸纯度：可通过提取物A260/A280比率判定 血清或血浆中病原体核酸纯化纯度：采用一种间接的方法，即使用已知病原体含量的溶血和/或脂血标本用待评价试剂提取，然后进行扩增检测，比较所得到的结果 临床标本核酸提取中可能存在的非源自标本的抑制和干扰物质 核酸提取中：许多试剂如乙二胺四乙酸(EDTA)、去垢剂如十二烷基硫酸盐(SDS)和chaotrope试剂如异硫氰酸胍和盐酸胍等、酚、氯仿、乙醇等有机溶剂 。 核酸样本制备及扩增检测的质控 对临床标本中可能存在的抑制/干扰物的质控措施 核酸提取及扩增有效性的质控 对临床标本中可能存在的抑制/干扰物的质控措施 质控措施： 采用内质控（internal control, IC）（通常称为内标）的方法 内标有两种,即竞争性的和非竞争性的内标。 核酸提取的质量控制 提取过程质控 设立强阳性质控品 提取过程中加入带颜色的内标 设立临界阳性质控品 各质控品和内标需符合说明书标准 感染性疾病的分子诊断 实例1 乙型肝炎病毒检测 乙型肝炎二对半检测 大三阳：1、3、5阳性 小三阳：1、4、5阳性 1、标本类型： 血浆、血清（血浆血清10倍） 2、阴性结果解读：DNA阴性并非无感染，判断 是否感染