毕业论文-人间充质干细胞携带dcc基因治疗卵巢癌的实验研究.doc

妇产科学专业优秀论文 人间充质干细胞携带DCC基因治疗卵巢癌的实验研究 关键词：卵巢肿瘤 基因疗法 充质干细胞 摘要：目的：研究DCC基因转染对卵巢癌细胞体外、体内的治疗作用及其对化疗药物敏感性的影响。初步探索问充质干细胞作为卵巢癌基因治疗的载体携带DCC基因治疗的可能性及方法。 方法：采用脂质体转染法将含有DCC基因的重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-DCC导入卵巢癌细胞系HO-8910中，经氨基糖甙类抗生素G418筛选，RT-PCR技术以及免疫组化法检测DCC基因mRNA及蛋白表达情况。四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定细胞生长情况及经梯度浓度顺铂及紫杉醇处理后的细胞存活率。电镜观察超微结构改变。将转染DCC基因的HO-8910细胞注入裸鼠皮下，观察移植瘤的生长情况及顺铂、紫杉醇的治疗效果，电镜观察超微结构。将pcDNA3.1(+)-DCC及脂质体混合物注入裸鼠体内，观察对卵巢癌移植瘤形成的预防作用。采用密度梯度离心法自脐带血中分离培养人MSCs，并构建了带有报告基因EGFP的重组质粒pcDNA3.1-(+)-DCC-IRES-EGFP，采用脂质体转染法将pcDNA3.1-(+)-DCC-IRES-EGFP转入MSCs中，荧光显微镜观察绿色荧光，RT-PCR检测DCCmRNA。将携带。DCC基因的MSCs注入裸鼠卵巢癌移植瘤，观察体内DCC基因表达情况。 结果：1、成功构建了携带DCC基因的重组真核表达载体pcDNA3.1-(+)-DCC-IRES-EGFP，表达绿色荧光蛋白的EGFP基因位于DCC基因下游，可以作为DCC基因表达指示标记。2、DCC基因被成功转入卵巢癌细胞中并获稳定表达。转染DCC基因后的卵巢癌细胞增殖受到抑制，出现凋亡征象，且对顺铂和紫杉醇的敏感性增加。转染DCC基因后的卵巢癌细胞裸鼠移植瘤的生长受到抑制，出现明显凋亡征象，注射携带DCC基因的重组质粒和脂质体对卵巢癌裸鼠移植瘤的形成有一定预防作用。顺铂和紫杉醇对转染DCC基因的卵巢癌细胞裸鼠移植瘤的抑瘤率明显增加。3、自脐带血中成功分离获得人间充质干细胞，可传代培养，可冻存复苏，经表面标志检测，表达CD29、CD44、CD105，不表达CD45和HLA-DR，具有多向分化潜能，在特定诱导条件下可向脂肪和骨分化。4、重组质粒pcDNA3.1-(+)-DCC-IRES-EGFP通过脂质体介导转染人间充质干细胞，荧光显微镜下观察到报告基因EGFP的表达，RT-PCR检测到了DCC基因mRNA。转染后的MSCs生长受到一定影响。携带DCC基因的MSCs注入裸鼠卵巢癌移植瘤后，短时间内能够表达DCC基因，随时间延长绿色荧光逐渐消失。 结论：DCC基因是重要的卵巢癌抑癌基因，可增加卵巢癌细胞的化疗敏感性，可作为卵巢癌基因治疗的侯选基因。脐带血可作为MSCs的来源。DCC基因可被成功转入MSCs中并获表达。转基因MSCs用于体内基因治疗的持久性和有效性仍需进一步研究。 正文内容 目的：研究DCC基因转染对卵巢癌细胞体外、体内的治疗作用及其对化疗药物敏感性的影响。初步探索问充质干细胞作为卵巢癌基因治疗的载体携带DCC基因治疗的可能性及方法。 方法：采用脂质体转染法将含有DCC基因的重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-DCC导入卵巢癌细胞系HO-8910中，经氨基糖甙类抗生素G418筛选，RT-PCR技术以及免疫组化法检测DCC基因mRNA及蛋白表达情况。四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定细胞生长情况及经梯度浓度顺铂及紫杉醇处理后的细胞存活率。电镜观察超微结构改变。将转染DCC基因的HO-8910细胞注入裸鼠皮下，观察移植瘤的生长情况及顺铂、紫杉醇的治疗效果，电镜观察超微结构。将pcDNA3.1(+)-DCC及脂质体混合物注入裸鼠体内，观察对卵巢癌移植瘤形成的预防作用。采用密度梯度离心法自脐带血中分离培养人MSCs，并构建了带有报告基因EGFP的重组质粒pcDNA3.1-(+)-DCC-IRES-EGFP，采用脂质体转染法将pcDNA3.1-(+)-DCC-IRES-EGFP转入MSCs中，荧光显微镜观察绿色荧光，RT-PCR检测DCCmRNA。将携带。DCC基因的MSCs注入裸鼠卵巢癌移植瘤，观察体内DCC基因表达情况。 结果：1、成功构建了携带DCC基因的重组真核表达载体pcDNA3.1-(+)-DCC-IRES-EGFP，表达绿色荧光蛋白的EGFP基因位于DCC基因下游，可以作为DCC基因表达指示标记。2、DCC基因被成功转入卵巢癌细胞中并获稳定表达。转染DCC基因后的卵巢癌细胞增殖受到抑制，出现凋亡征象，且对顺铂和紫杉醇的敏感性增加。转染DCC基因后的卵巢癌细胞裸鼠移植瘤的生长受到抑制，出现明显凋亡征象，注射携带