高速逆流色谱分离纯化木蝴蝶中黄芩素和白杨黄素.PDFVIP

高速逆流色谱分离纯化木蝴蝶中黄芩素和白杨黄素 孙爱玲　孙清华　柳仁民 3 (聊城大学化学化工学院 , 聊城 252059) 摘 　要 　建立了高速逆流色谱分离纯化木蝴蝶黄芩素和白杨黄素的方法。两相溶剂系统为石油醚 2乙酸乙 酯 2甲醇 2水 ,固定相为 5∶5∶5∶5 (V /V )体系的上相 ,以 5∶5∶5∶5 (V /V )和 5∶5∶7∶3 (V /V )体系的下相为流动相进行 梯度洗脱。从 300 mg木蝴蝶粗提物中一步分离纯化得到 2515 mg黄芩素和 3616 mg白杨黄素。经高效液相 色谱分析 ,纯度分别为 9912%和 100%。其化学结构由 1 H2NMR和 13 C2NMR鉴定。 关键词 　高速逆流色谱 ,木蝴蝶 ,黄芩素 ,白杨黄素 　2005209206收稿 ; 2006201228接受 1　引　　言 木蝴蝶为紫葳科植物木蝴蝶 (O roxylum indicum (L. ) Vent. )的干燥成熟种子 ,是我国常用中草药 之一 ,并被收入中国药典 [ 1 ] ,具有止痛、止咳及清热等作用 ,用于治疗感冒、支气管炎和其它一些疾病。 　图 1　黄芩素 (R =OH)和白杨黄素 (R = H)的 化学结构式 Fig. 1　Chem ical structure of baicalein (R =OH ) and chrysin (R = H) 黄芩素和白杨黄素为木蝴蝶主要有效成分 ,具有清热、抗过 敏 ,抗氧化和抗癌等功能。近几年来对木蝴蝶中黄酮类成 分的研究非常活跃 [ 2～4 ]。因此 ,建立相关成分的高效分离 纯化方法具有重要意义。 高速逆流色谱 (HSCCC)是一种不使用固态支撑体或 载体的液液分配色谱技术。它克服了固相载体对样品的吸 附损失、变性等缺点 ,并可以在短时间内实现高效制备性分 离 [ 5 ] ,因而在中药有效成分的分离与纯化方面得到了广泛 的应用 [ 6～11 ]。本实验应用 HSCCC从木蝴蝶药材中成功地 分离纯化出黄芩素和白杨黄素 (结构见图 1) ,经高效液相 色谱 (HPLC)分析 ,其纯度分别为 9912%和 100%。 2　实验部分 2. 1　仪器、试剂与材料 TBE2300A高速逆流色谱仪 (上海同田生化技术有限公司 ) ; ? KTA p rime泵及检测系统 (瑞士安玛 西亚生物有限公司 ) ; HX21050恒温器 (北京博医康实验仪器有限公司 ) ; 1100高效液相色谱仪 (美国安 捷伦公司 ) ;色谱柱 : Spherigel ODS C18 (250 mm ×416 mm, 5μm ) ;Mercury p lus 400核磁共振仪 (美国瓦 里安公司 )。 粗提物的制备及 HSCCC分离用溶剂 (石油醚、乙酸乙酯、甲醇等 )均为分析纯 (天津化学试剂三 厂 )。HPLC分析用甲醇为色谱纯 (禹城化工厂 ) ,实验用水为二次蒸馏水。 木蝴蝶药材购于聊城市利民大药店 ,经山东中医药大学张永清教授鉴定为正品药材。 2. 2　样品制备 取 100 g于 60℃恒重的木蝴蝶药材粉碎 ,用 700 mL 70%甲醇回流提取 3次 (每次 2 h) ,合并提取 液 ,减压蒸馏 ,得浸膏 3413 g。浸膏加水溶解后用其 3倍体积的正丁醇萃取 3次 ,合并正丁醇部分 ,减压 蒸馏回收溶剂 ,得浸膏 1616 g。此浸膏再用石油醚 2乙酸乙酯 2甲醇 2水 (5∶5∶5∶5, V /V )体系的下相 100 mL 溶解后 ,取等体积的上相萃取 4次 ,合并上相部分 ,减压蒸馏得淡黄绿色粉末 (即木蝴蝶药材的粗提物 ) 518 g,放置冰箱内备用。 第 34卷 2006年 9月 　　　　　　　　　　　　 分析化学 ( FENX I HUAXUE) 　研究简报 Chinese Journal of Analytical Chem istry 　　　　　　　　　　　 特刊 S243～S246 2. 3　分配系数的测定 本实验用 HPLC测定样品在不同溶剂体系的分配系数。取适量木蝴蝶药材的粗提物于 5 mL试管 中 ,用预先达到分配平衡的两相溶剂系统的下相将其溶解 ,用 HPLC进行检测 ,峰面积为 A 1 。然后取等 体积的上相加入此溶液 ,剧烈振荡使其充分混合 ,待达到分离平衡后 ,再取下相用 HPLC检测 ,峰面积为 A2。分配系数 K则按下式计算 : K = (A1 - A2 ) /A2。 2. 4　两相溶剂系统及样品溶液的制备 本实验所用溶剂系统为石油醚 2乙酸乙酯 2甲醇 2水 (5∶5∶5∶5和 5∶5∶8∶2, V /V ) ,按其比例分别将各种 溶剂加入分液漏斗中 ,剧烈振荡使溶液充分混合 ,分相平衡后 ,分出上相和下相 ,使用前分别用超声波脱 气 30 m