流式细胞仪的原理与应用2讲述.ppt

流式细胞仪的原理与应用The principles and applications of Flow Cytometry 焦 鹏 流式细胞术 是一种能快速测量细胞的物理或化学性质的高技术。利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。与传统荧光镜检查相比，具有速度快、精度高、准确性好等优点， 成为当代最先进的细胞定量分析技术。? 流式细胞仪的原理与应用 一　流式细胞仪的原理 二　流式细胞仪在生物医学中的应用 流式细胞仪特点 流式细胞仪的检测范围 细胞结构 细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量 细胞功能 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体 1．流式细胞仪的分析速度：一般流式细胞仪每秒检测3000～?6000个细胞, 大型机可达每秒几万个细胞。 2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度： 一般能测出单个细胞上600个荧光分子, 两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。3．前向角散射光（FSC）检测灵敏度： 前向角散射光（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。 2 流式细胞仪的基本结构 光学系统 液流系统 电子系统 数据处理系统 分选系统 FACSCalibur流式细胞仪的光路图 激光-- 激光 (Laser)是一种相干光源，它能提供单一波长、单一方向、同步的稳定光照 单色性好，方向性好，亮度高，可提高分辨力 激光波长: 488nm, 635nm FACSCalibur的激光系统 经常使用的荧光素 FITC Fluorescein isothiocyanate PE Phycoerythrin PerCP Peridinin chorophyll protein APC Allophycocyanin PI Propidium iodide 荧光信号 荧光素标记特异抗体 荧光素吸收激光能量，产生跃迁 回到基态，荧光素将吸收能量释放，转换为振动能和热能，释放较入射光波长更长的光量子 荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强 双激光立体空间激发系统 双激光，两点激发，实现4色荧光分析 最大程度地减少荧光信号之间的补偿，提高检测灵敏度 双激光的应用大大扩展了染料的选择范围，亦相应地扩大了仪器的应用领域 流式细胞仪可检测到的细胞参数 1 前向角散射（FSC）：前向角散射光的强度与细胞的大小有关，也就是说，同一个细胞群体，FSC强的，其细胞大一些，而FSC弱的，其细胞小一些。 2 侧向角散射（SSC）：侧向角散射又称90°散射或大角散射。侧向角散射光对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，对胞内较大的颗粒也会有反应。所以，侧向角散射光的强弱可反应细胞内精细结构和颗粒的性质。 3 荧光强度（FL）：是细胞或细胞上的荧光染料被激光激发后发射出的荧光，不同的荧光染料其发射波长不同。通过荧光强度可将同一个细胞群体中的有荧光标记的细胞与无荧光标记的细胞区分开来，也就是我们通常所说的阳性细胞，也可以将阳性细胞中的高FL的细胞与低FL的细胞区分开来，也就是可以把强阳性细胞和弱阳性细胞区分开来。一般的流式细胞仪只装有一个激光光源（488nm），可测出三个FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式细胞仪装有两个或三个激光光源（488nm、633nm和325nm），可测出4或6个FL。 前向角散射光（FSC, Forward Scatter） 细胞相对大小及其表面积 侧向角散射（SSC, Side Scatter） 细胞粒度及细胞内相对复杂性 FSC和SSC两种信号都是来自于激光原光束，其波长与激光相同，目前采用这两个参数组合，可区分裂解红细胞处理后外周血白细胞中淋巴细胞、单核细胞和粒细胞三个细胞群体，或在未进行裂解红细胞处理的全血样品中找出血小板和红细胞等细胞群体。 外周血细胞散射光双参数点图（裂解红细胞后） 测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。 此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。 使用不同荧光素标记不同单克隆抗体对细胞进行染色，做多色分析 荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量 荧光信号 FACSCalibur流式细胞仪液流系统 流式细胞仪的电子系统 进行信号检测和分析 当