关于透射电镜和扫描电镜等的样品制备讲义.ppt

第六章 扫描电子显微镜的样品制备技术 6.1 SEM样品制备的基本要求 SEM对样品基本要求： 基本性质：干净、干燥、导电、不发光、 不发热、磁性弱。 大 小：直径最大不宜超过10 mm，高度在3-5 mm之间，在满足观察的情况下，样品尽量小为宜。 对试样的要求试样可以是块状或粉末颗粒，试样大小要适合仪器专用样品座的尺寸，不能过大。样品座尺寸各仪器不尽相同，一般小的样品座为 Φ 3 ～ 5mm ，大的样品座为 Φ 30 ～ 50mm ，以分别用来放置不同大小的试样，样品的高度也有一定的限制，一般在 5 ～ 10mm 左右。 表面受到污染的试样，要在不破坏试样表面结构的前提下进行适当清洗，然后干燥。 新断开的断口或断面，一般不需要进行处理，以免破坏断口或表面的结构状态。有些试样的表面、断口需要进行适当的侵蚀，才能暴露某些结构细节，则在侵蚀后应将表面或断口清洗干净，然后烘干。 要求在真空中能保持稳定，含有水分的试样应先干燥除去水分。 对磁性试样要预先去磁，以免观察时电子束受到磁场的影响。 要求导电，不导电的观察前进行导电处理。 块状试样扫描电镜的试样制备是比较简便的。对于块状导电材料，除了大小要适合仪器样品座尺寸外，基本上不需要进行什么制备，用导电胶把试样粘结在样品座上，即可放在扫描电镜中观察。对于块状的非导电或导电性较差的材料，要先进行镀膜处理，在材料表面形成一层导电膜。以避免电荷积累，影响图象质量。并可防止试样的热损伤。 6.1.2块状试样的制备 6.1.3粉体试样的制备 粉体可以直接撒在样品座的双面碳导电胶上，用平的表面物体，例如玻璃板压紧，然后用洗耳球吹去粘结不牢固的颗粒。 对细颗粒的粉体分析时，特别是形貌观察时，将粉体用酒精或水在超声波清洗机内分散，再用滴管把均匀混合的粉体滴在样品座上，待液体烘干或自然干燥后，粉体靠表面吸附力即可粘附在样品座上。 在制备SEM样品时，必须掌握以下原则： (1)每一操作过程，都应注意防止样品的污染和损伤，使被观察的样品尽可能保持原有的外貌和微细结构； (2)去除样品内水份，以利于维持SEM的真空度和防止镜筒的污染。但在脱水和干燥处理时，要尽量减少避免样品体积变小和收缩变形等人工假象；　　 (3)降低样品表面的电阻率，增加样品的导电性能，以提高二次电子发射率，建立适度的反差和减少样品的充放电效应；　 (4)观察组织细胞的表面或内部微结构，应注意和保护样品的观察面。 用生物样品做冷冻超薄切片的取材原则是快、准、小，样品越新鲜越好。但生物样品含水量高，如果不经冷冻保护，即使样品块已足够小，在冷冻固定和冷冻超薄切片的过程中仍易形成冰晶而破坏样品的超微结构。有多种保护剂，如：甘油溶液、二甲基亚砜溶液、高浓度蔗糖溶液等，根据样品的情况选择冷冻保护剂。一般组织的含水量越高，所需冷冻保护剂的浓度也越高，因为这样能保证冷冻固定时达到“玻璃化”而不产生冰晶。以达到冷冻保护的目的为前提，用冷冻保护剂处理的时间可依样品的要求而定，一般从10min到几个小时不等。其实，冷冻保护的原理是，用高浓度的冷冻保护剂处理生物样品之后，样品中所含的游离态的水与冷冻剂结合，使样品中液体的浓度提高，与此同时就降低了样品的冷冻点，这与盐水不易冻结的道理是一样的，其结果是防止样品中形成冰晶。 取材与冷冻保护 有时还可以在冷冻保护之前先对样品进行预固定，以提高样品结构的稳定性。常用醛类做预固定剂。根据研究的目的和材料来选择预固定剂和固定的条件。一般研究超微形态学可以选用2.5％的戊二醛溶液，4摄氏度下固定15～60分钟。 直接冷冻固定含水分高的新鲜生物样品时，即使选择最佳固定条件，也难使样品完全达到玻璃化而无冰晶损伤。一般固定效果理想的区域只是从样品表面算起约10微米以内深度的那部分。因此，为了提高冷冻固定的质量，可先选用金属镜冷冻固定法，使样品的内表面平整，再于低温条件下，用预冷的修块刀将样品平面整修出一个小平面，面积约有0.2mm，然后再进一步冷冻固定。如果样品需要预固定，则可以在预固定的过程中，用锋利的刀片将样品的头部切成方形或梯形，冷冻固定时注意把修好的那面调节到切片的位置上，使切片平整且大小适宜。 快速冷冻固定 冷冻超薄切片质量的好坏直接决定于快速冷冻效果。常用的快速冷冻方式有二： 一是液氮直接冷冻； 二是金属接触冷冻。后一种方法较好，即将铜块先置于液氮中，待温度平衡后，将样品与铜块接触5～10秒钟，以达到快速传导降温的目的，然后再将样品置于液氮中待用。 有很多冷冻固定装置，目前常用的有KF80冷冻固定装置、KF80.MM80金属镜冷冻固定装置和MM80E金属镜冷冻固定装置。 冷冻样品的保存：当冷冻固定的样品一时用不完时，可以保存一段时间，保存方法有以下几种： 将样