第二章基因工程工具酶分解.ppt

第二章 基因工程工具酶 酶活性与热稳定性 酶蛋白分子量 94KDa，比活性200 000∪/mg，Taq酶的浓度通常为1~2.5∪/?l，太多浪费并易导致非特异性扩增。 热稳定性好：能耐受DNA变性时的高温 在92.5℃、95℃ 、97.5℃时，PCR混合物中的Taq DNA聚合酶分别经130min、40min、5min后，仍可保持50%的活性。 PCR反应时变性温度为95℃～20sec，50个循环后，Taq DNA聚合酶仍有65%的活性。 Taq DNA聚合酶是Mg2+ 依赖性酶，对Mg2+ 浓度非常敏感。 Mg2+浓度2.0mmol/L时，能最大限度地激活TaqDNA聚合酶的活性。 Mg2+ 能与dNTP结合而降低PCR反应液中游离的Mg2+ 浓度，优化浓度一般反应 中Mg2+ 浓度至少应比dNTP总浓度高0.5～1.0 mmol/L。 适当浓度的KCl能使Taq DNA聚合 酶的催化活性提高50～60%。 离子依赖性 TaqDNA聚合酶具有5′→3 ′聚合酶活性和5′→3ˊ外切酶活性，而无3′→ 5′外切活 性，在PCR反应中如发生某些碱基的错配，该酶是没有校正功能。Taq DNA聚合酶的碱基错配机率为2.1×10-4。 Taq DNA聚合酶还具有逆转录酶活性. 忠实性 Taq酶的最适温度 最适温度： 72-78 oC 延伸速度： 约1000nt/min酶分子 最长延伸长度：6.7kb （1）由ATP（或NAD+）提供AMP，形成酶-AMP复合物，同时释放出PPi或NMN； （3）连接机理 （2）激活的AMP结合在DNA链5’端的磷酸基团上，产生含高能磷酸键的焦磷酸酯键； （3）与相邻DNA链3’羟基相连，形成磷酸二酯键，并释放出AMP。 （4）不同末端连接策略 ①单酶切产生的相同黏性末端 ②双酶切产生的黏性末端 ③双酶切产生不同的5?突出末端 ④双酶切产生不同的3?突出末端 ⑤双酶切产生的5?突出末端和3?突出末端 ⑥平切产生的平末端 平末端DNA片段的连接操作 从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多 提高平末端连接效率的方法包括： 加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接） 加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会 加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用 加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM 常用的平末端DNA片段连接法，主要有同聚物加尾法、衔接物连接法及接头连接法 同聚物加尾法 衔接物连接法 衔接物（linker），是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平末端的双链寡核苷酸短片段。 DNA接头，是一类人工合成的一头具某种限制酶粘性末端另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸短片段。 Tris-HCl 50-100 mM pH 7.5 MgCl2 10 mM ATP 0.5 - 1mM DTT 5 mM Volume 10 - 20μl Tep. and Time 4-15 ℃, 4 - 16 hr 1 U DNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15 ℃反应 1 小时，完全连接 1 μgλ DNA（Hind III片段）所需的酶量 （5） DNA连接酶的反应条件 增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。 插入片段与载体的浓度比例 反应温度 插入片段浓度高，至少2︰1。 一般14~16℃ （6） 影响DNA连接反应的因素 平末端DNA分子的连接最适反应的酶量为1~2个单位， 粘末端的连接，酶量为0.1个单位较好。 DNA连接酶用法与用量 4、 DNA聚合酶（ligase） （1）DNA聚合酶的概念和类型 DNA聚合酶：指在DNA(或RNA)模板指导下，以4种脱氧核糖核苷酸（dNTP）为底物，在引物3’ -OH末端聚合DNA链的一类酶。 DNA聚合酶的类型 根据DNA聚合酶所使用的模板不同，将其分为两类： （1）依赖于DNA的DNA聚合酶； （2）依赖于RNA的DNA聚合酶。 大肠杆菌DNA聚合酶 Klenow fragment (克列诺酶) T7 DNA聚合酶 T4 DNA聚合酶 修饰过的T7 DNA聚合酶 逆转录酶 （2）常见DNA聚合酶及共有特点 以脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)为前体催化合成DNA; 需要模板和引物的存在; 不能起始合成新的DNA链; 催化dNTP加到生长中的DNA链的3-OH末端; 催化DNA合成的方向是5→3。 共同特点 主要区别 持续合成能力和外切酶活性不同 。 T7 D