第10章核酸的生物合成分解.ppt

第十章 核酸的生物合成 第一节 DNA的生物合成 DNA Biosynthesis 一、DNA的复制 二、逆转录 三、 DNA的损伤和修复 四、多聚酶链式反应（PCR） 一、DNA的复制 DNA分子是如何通过复制把遗传信息高度保真性地（fidelity）传递给子代细胞的？ 概念：DNA在复制时，以亲代DNA的每一股作模板，合成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链，这种现象称为DNA的半保留复制(semi-conservative replication)。 半保留复制的生物学意义 按半保留复制方式，子代DNA与亲代DNA的碱基序列一致，即子代保留了亲代的全部遗传信息，体现了遗传的保守性。 遗传的保守性，是物种稳定性的分子基础，但不是绝对的。 DNA在复制时，需在特定的位点起始，这是一些具有特定核苷酸排列顺序的片段，即复制起始点(origin) 。 在原核生物中，复制起始点通常为一个，而在真核生物中则为多个。 放射自显影证实亲代链解开后立即进行复制，没有发现单链DNA。 习惯上把两个相邻DNA复制起始点之间的距离（或DNA片段）定为一个复制子(replicon) 。 复制子是独立完成复制的功能单位。 DNA复制时，局部双螺旋解开形成两条单链，这种叉状结构称为复制叉。 3、复制方式 E.coil基因结构与复制起点 DNA聚合酶只能以5→3方向聚合子代DNA链，即模板DNA链的方向必须是3→5。 由于DNA分子中两条链的走向相反，因此当分别以两条亲代DNA链作为模板聚合子代DNA链时，子代链的聚合方向也是不同的。 冈崎片段： ? 1968年日本生化学者冈崎用电镜及放射自显影技术，观察到DNA复制中出现一些不连续的片段，将这些不连续的片段称为冈崎片段。 ? 原核生物: 1000~2000个核苷酸 ? 真核生物: 100~200个核苷酸 以3’→5’方向的亲代DNA链作模板的子代链在复制时基本上是连续进行的，其子代链的聚合方向为5’→3’，这一条链被称为领头链(leading strand)。 以5’→3’方向的亲代DNA链为模板的子代链在复制时则是不连续的，其链的聚合方向也是5’→3’，这条链被称为随从链(lagging strand)。 领头链连续复制而随从链不连续复制，就是复制的半不连续性。 （二） DNA复制的体系 底物: dNTP (dATP、dGTP 、dCTP 、dTTP) 聚合酶: 依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-pol) 模板: 解开成单链的DNA母链 引物: 提供3-OH末端的寡核苷酸 其他酶和蛋白质因子: 拓扑异构酶、解螺旋酶、单链DNA结合蛋白、引物酶、连接酶 聚合反应的特点 以DNA单链为模板 以dDNA为原料 引物提供3′－OH 聚合方向为5 ′→ 3′ 1、拓扑异构E（动画） 拓扑异构E 3、单链DNA结合蛋白 (SSB ) 4、引发酶和引发体 引物酶的作用：为DNA聚合酶提供自由的3′－OH RNA引物的大小，在原核生物中通常为50~ 100个核苷酸，而在真核生物中约为10个核苷酸。RNA引物的碱基顺序，与其模板DNA的碱基顺序相配对。 5、DNA 聚合酶 全称：依赖DNA的DNA聚合酶 ( DNA-dependent DNA polymerase, DDDP ) 简称：DNA-pol 活性：1. 5??3? 的聚合酶活性 2. 核酸外切酶活性 大肠杆菌中至少有5 种，分别命为DNA 聚合酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ。 ① DNA 聚合酶I（单体酶：单肽链） 主要功能：负责DNA 的损伤修复及在DNA 复制中切除引物，填补空隙的作用。 若用枯草杆菌蛋白酶处理此酶，可得两个片段。 5 ? →3 ?聚合酶活性 3’→5’外切酶活力 DNA 聚合酶I小结 ②DNA 聚合酶Ⅱ（单体酶） 主要功能参于DNA 的损伤修复，具有5′→3 ′聚合活力，较弱，3′ →5′外切活性。但无5′ →3′外切活性。 ③DNA 聚合酶 Ⅲ（寡聚酶） 是催化大肠杆菌DNA 复制的主酶，全酶有10 种亚基，含Zn2+。 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅲ全酶的结构和功能 真核 DNA聚合酶 DNA连接酶(DNA ligase)可催化两段DNA片段之间磷酸二酯键的形成，从而把两段相邻的DNA链连接成一条完整的链。 连接酶连接切口 DNA连接酶催化的条件是： ① 需一段DNA片段具有3-OH，而另一段DNA片段具有5-Pi基； ② 未封闭的缺口位于双链DNA中，即其中有一条链是完整的； ③ 需要消耗能量，在原核生物中由NAD+供能，在真核生物中由ATP供能。 DNA复制酶系总览 （三）原核生