人类辅助生殖技术应用概述讲义.ppt

非整倍体筛查-SNP芯片 实验室基本条件 胚胎培养环境和质量控制 胚胎培养系统 精子，卵子和胚胎 受精和胚胎发育 配子和胚胎的冷冻复苏 显微操作技术的应用 * * * * * 在选购仪器时，不仅要根据工作量而定，而且还要考虑到重要仪器出现故障时产生的影响。比如说显微操作仪以及程序冷冻仪等。 在胚胎操作过程中，不同的操作对于显微镜有不同的要求。 * ＩＶＦ工作站是ＩＶＦ实验室不可缺少的设备，可以使配子和胚胎操作区达到百级洁净度。此外，IVF工作站中的恒温台对于胚胎和配子在体外的操作是十分重要的。 定期更换初效和高效保证IVF工作站的正常运转。 * 培养箱主要是模拟体内环境，为配子和胚胎提供相对稳定的体外生长环境，比如说稳定的酸碱度，温度和湿度。配子和胚胎离开人体之后所有的时间都是在培养箱中度过的，因此培养箱的精确性对实验室来说是十分重要的。 * * * * * 所有的培养液都需要在前一天配制，在培养箱中预平衡到最佳的温度和pH值 * 如果将培养基从培养箱中拿出来，在很短的时间内温度和pH值的变化就比较大。 * 胚胎培养一般分为单气培养和三气培养。 * 人类的配子分为精子和卵子。 * * * 体外受精就是将精子和卵子在人体外进行混合，使卵母细胞受精成为胚胎的一种方法。第一种方法就是将一定数目的精子加入到放有卵子的培养皿中。第二种方法就是将卵母细胞加入到含有精子的培养滴中。一般情况下，受精是在盖有石蜡油的培养基中进行的，这样可以防止污染。 * 传统的体外受精方法难以解决男性少弱精导致的受精障碍。为了克服这个问题，可以直接将精子注射到卵子胞浆内，这样就可以获得较高的受精率。这一技术解决少弱精，手术取精来源精子的受精问题。 * * * * * 在精子卵子和胚胎的冷冻过程中，水由液态变为固态时体积会增大，大的冰晶会对胚胎产生毁灭性的损伤，所以在冷冻的过程中最主要的工作就是防止冰晶的形成。 * * * * 胚胎活检是从第三天或者第五天的胚胎中取出一个或者多个细胞进行遗传学诊断，筛选出基因或者染色体正常的胚胎进行移植的一种手段。现在PGD主要应用于染色体异常，单基因病和HLA配型。 * 2、管理： A、按功能和清洁度分区 B、实验室禁止吃，喝，抽烟以及使用化妆品 C、培养箱和温台的监测 D、冰箱的监测 E、液氮罐的监测 实验室禁止使用酒精等可挥发性有机物和紫外照射 可用蒸馏水擦拭台面 可用专用洗涤剂擦拭可能会被污染的台面或者区域 可使用吸尘器吸走灰尘 培养箱的清洁和消毒 1、温度和湿度：37.0±0.1℃，90% 2、pH：7.1 ≤ pHi ≤ 7.2， 7.2≤ pHe ≤7.4 3、气体：CO2和O2 4、渗透压：270 ～ 290mOsm/kg 培养基的基本组成 水：99% 无机盐：维持培养基的渗透压和酸碱度 碳水化合物：提供胚胎发育的能量 氨基酸：促进胚胎体内外发育 维生素：调控细胞代谢 激素和生长因子：促进胚胎发育 大分子物质：维持胶体渗透压，中和毒素 抗氧化剂：减少氧自由基对胚胎的损伤 螯合剂：螯合重金属离子 抗生素：防止污染 培养液配制和平衡 单气培养：CO2(5-6%)，O2(21%) 和N2(74%) 三气培养：CO2(5-6%)，O2(5%) 和N2(90%) 优势：更接近生理状态（2-8% O2） 1、精子的形态结构 精子形态 精子变态示意图 卵母细胞颗粒细胞复合体 GV 期 MI 期 MII 期 异常卵母细胞 1、常规体外授精 精卵混合 精卵结合 单原核 多原核 三原核 无原核 胚胎发育阶段：卵裂球的数目 胚胎形态学评分： 胚胎的碎片评分： 8-1-1 8-2-1 8-2-3 1期：囊胚腔小于胚胎体积的一半 2期：囊胚腔大于胚胎体积的一半 3期：完全囊胚，囊胚腔与胚胎体积相等 1期 2期 3期 4期 5期 6期 4期：扩张囊胚，囊胚腔大于胚胎，透明带变薄 5期：孵化囊胚，胚胎部分孵出 6期：完全孵化囊胚 胚胎移植数目： 35岁以下第一周期：2个 35岁以上或者第二周期以上：3个 单胚胎移植： 胚胎移植管 空气 空气 胚胎 培养基 1、精子冷冻： 2、卵子冷冻： 3、胚胎冷冻： 4、生殖组织冷冻： 程序化冷冻（慢速冷冻） 玻璃化冷冻（快速冷冻） Slow cooling - 0.3°C/min 慢速冷冻法 将胚胎放入含有一定浓度的冷冻保护剂处理后，慢速降温（0.2~3℃/min ）, 在这个过程中，随着细胞外温度的逐渐降低和细胞外冰晶的形成，细胞以一种平衡的方式逐步脱水。直到温度降至-150 ℃，至于液氮保存。 Vitrification - 50.000°C/min 1 sec. 玻璃化冷冻法 采用更高浓度的冷冻保护剂处理细胞，快速降温，使细胞内外的液体均达到玻璃化状态 玻璃化