第二章组织培养基本技术分解.ppt

缺锌症状： 小叶病，叶片变小，两节之间缩短。叶脉间失去绿色或者变白。 植物缺素症 缺氮：首先表现在老叶上均一的缺绿现象； 缺磷：老叶片发蓝稍带紫色，叶缘变为紫红色，叶尖枯死； 缺钾：先表现在老叶斑驳的缺绿症状叶缘枯黄，卷曲皱缩，茎的节间变短； 缺钙：新叶叶片变小、枯死，即干烧心； 缺硫：首先表现为新叶叶片缺绿或发紫； 缺锰：新叶脉间失绿； 缺铁：叶片黄，叶脉绿； 缺硼：顶呀和附近的嫩叶变黑坏死，生长矮化，丛枝； 缺锌：老叶脉间缺绿，出现白色坏死斑； 缺铜：新叶上由叶尖沿叶缘逐渐坏死，严重整叶萎蔫过早脱落； 缺钼：不能形成花器或花早落。 第四节 外植体的选择和灭菌 一、 外植体的选择 二、 外植体的灭菌方法 三、 污染原因和预防措施 二、外植体的灭菌方法 2、污染的预防措施 发现污染的材料应及时处理，否则将导致培养室环境污染。 对一些特别宝贵的材料，可以取出再次进行更为严格的灭菌，然后接入新鲜的培养基中重新培养。 要处理的污染培养瓶最好在打开瓶盖前，先集中进行高压灭菌，再清除污染物，然后洗净备用。 现就根据污染途径，阐述污染的几个预防措施: （2）选择合适的时间去田间采取外植体 避免阴雨天去田间采取外植体。 在晴天采取外植体时，下午采取的外植体要比早晨采的污染少，因材料经过日晒后可杀死部分细菌或真菌。 但目前对材料内部污染还没有令人满意的灭菌方法。在菌类长入组织内部时，不但要除去上年生的鳞片，甚至要除去韧皮组织，只接种内部的分生组织，以收到一定的防污染效果。 （2）多种药液交替浸泡法 对容易污染而难灭菌的材料： 首先取茎尖、芽或器官外植体，用自来水及肥皂充分洗净，表面不可附着污垢、灰尘，用剪刀修剪掉外植体上无用的部分，剥去芽上鳞片； 第2，将材料放入70%酒精中灭菌数秒钟； 第3，在1：500Roccal B（一种商品灭菌剂名）稀释液中浸5min； 第4，放入5%—10%次氯酸钠溶液中并滴入“吐温80”数滴，灭菌15—30min，或浸入0.1%—0.2%升汞溶液中并加入“吐温80”数滴，灭菌5—10min； 第5，用无菌水冲洗5次。也可从次氯酸钠溶液中取出后，再放入无菌的0.1M盐酸中浸片刻，再用无菌水冲洗数次。 3）玻璃器皿的灭菌 湿热灭菌法——即将玻璃器皿包扎后置入蒸汽灭菌锅中进行高温高压灭菌，灭菌时间可延长达25min—30min。 干热灭菌法——即将玻璃器皿置入电热烘箱中进行灭菌。 煮沸灭菌——即将玻璃器皿放入水中煮沸进行灭菌。 4）金属器械的灭菌 5）布质制品的灭菌 湿热灭菌法：工作服、口罩、帽子等布质品均用湿热灭菌法，即将洗净晾干的的布质品，放入高压锅中，121?C的温度，灭菌20 min～30min。 6）无菌操作室的灭菌 在接种前要剪除指甲，并用肥皂或洗衣粉溶液洗手，最好再在新洁尔灭溶液中浸泡10min，后用75%的酒精擦手，并用75%的酒精擦拭母种瓶表面进行消毒，以防把微生物带进超净工作台。 工作人员在接种时，最好不要感冒咳嗽和说话。操作人员操作动作要熟练、动作快、规范，这样可以缩短操作时间，减少污染。如脱毒培养抽取茎尖很小，操作时间长了就会使茎尖失水变干，或不慎感染杂菌。 小 结 第一节 外植体的选择 ：优良种质、健壮植株 、最适的时期、适宜的大小。 第二节 外植体的灭菌方法：9种常用灭菌药剂的使用及其效果 、外植体的灭菌方法。 第三节 污染原因和预防措施：污染的原因、污染的预防措施（防止材料带菌、外植体的灭菌、器皿与金属器械的灭菌、布质制品的灭菌、无菌操作室的灭菌、操作人员在接种时一定要严格按照无菌操作的程序进行）。 一、外植体的接种 1、光照 对离体培养物的生长发育，光照条件有重要的作用。通常对愈伤组织的诱导，在黑暗条件下有利，在有光条件下培养的愈伤组织质地和颜色也有不同。但分化器官需要光照，并随着芽苗的生长需要加强光照。加强光照，可以使小苗生长健壮，促进“异养”向“自养”转化，提高移植的成活率。普通培养室要求每日光照12h-16h，光照强度1000lx-5000lx。如果培养材料要求在黑暗中生长，可用铝箔或者适合的黑色材料包裹在容器的周围，或置于暗室中培养。 2．温度 离体培养中对温度的调控要比光照显得更为突出。不同的植物有不同的最适生长温度，大多数植物最适温度在23?C-32?C之间。培养室一般所用的温度是25?C±2?C。低于15?C或高于35?C，对生长都是不利的。 4．氧气 植物组织培养中，外植体的呼吸需要氧气。在液体培养中，振荡培养是解决通气的良好办法。 第六节外植体的褐变及其预防措施 （2）材料年龄 幼龄材料一般都有比成龄材料褐变轻的趋势。平吉成从小金海棠、八楞海棠和山定子刚长成的