第九章亲和纯化技术分解.ppt

四、 载体的活化与偶联 * Q:载体在于配基偶联前为什么要“活化”？ A：载体相对“惰性”，不能直接与配基连接（不容易发生化学反应），因此在偶联前（载体与配基对接），需要对载体进行“活化” 活化的方式有很多种…… 载体的活化的方式 * 多糖类载体 聚丙烯酰胺凝胶载体的活化法 * 酰胺基 + 含氮化合物 → 胺衍生物 五、 影响吸附亲和力的几个因素 * * ※六、 配基与间隔臂的连接 （一）、含氮配基的连接 （二）、含羧基配基的连接 （三）、含巯基配基的连接 （四）、含醛基、酮基、羟基配基的连接 七、 亲和层析的吸附和洗脱 * * （一）、影响吸附的条件 * 1、亲和吸附剂及配体的性质 缓冲液的种类、离子强度、pH、温度和层析流速有关。 2、温度 升高会使吸附作用减弱。 3、流速 每小时低于10 ml/cm2。 4、上样体积 为柱床体积的5%。 * 离子效应 * 配基与载体-间隔臂的不完全结合，将无关离子基团引入吸附剂。 具有离子基团的亲和吸附剂会影响蛋白质的洗脱行为。 疏水基团 * 吸附剂疏水性基团与蛋白质结构中的疏水区相互吸引，形成非专一性吸附。 疏水基团： （1）长的烃链结构的“手臂”：烃链 （2）疏水性配基 复合亲和力 * 离子效应作用，又有疏水作用。 提高选择性 对每一具体系统找出最佳的配给浓度、pH、离子强度和温度。 （二）、亲和层析的洗脱 * 非专一性洗脱 * 改变洗脱剂的pH以影响电性基团的解离程度 离子强度的分步和梯度变化 降低缓冲液极性 特殊洗脱 * 断裂方法有： 硫酯键用羟胺处理30分钟； 偶氮键用连二亚硫酸钠硼酸缓冲液处理； 二硫键用巯基乙醇、半胱氨酸、二硫苏糖醇等处理。 专一性洗脱 * 竞争性效应——正洗脱 非竞争性效应——不能达到洗脱目的 反竞争性效应——负洗脱 专一性洗脱 竞争性效应，即ESI不如EI稳定，增加洗脱剂中I，会使E洗脱下来（正洗脱）。 * S（固定化配基），E（酶），I（游离配基） 专一性洗脱 非竞争性效应，即ESI稳定性与EI相同，I的存在不影响E对S的结合，用I不能达到洗脱的目的。 * S（固定化配基），E（酶），I（游离配基） 专一性洗脱 * 反竞争性效应，即ESI比EI稳定，I使E与S结合更紧密。 增加了酶与配基的结合力及亲和吸附的选择性 将I除去——“负洗脱” 反竞争性效应 * * 配基的选择和洗脱条件 * （三）、亲和吸附剂的再生 用缓冲液充分平衡后即可重复使用。 亲和力下降，非特异吸附增加，大多由变性蛋白沉积造成，用6mol/L脲洗柱。 思考题 某研究生在重组表达某一目的蛋白质分子T时，人为地在编码蛋白质氨基酸序列的DNA终止序列前加了一段核苷酸序列，如成功表达，获得的目的蛋白质分子的C末端将有一段氨基酸序列，为：His-His-His-His-His-His。 他这么做的目的是什么？ 如他要纯化该目的蛋白，需要使用什么样的材料？如何纯化？ * * 第九章 亲和纯化技术 * 第九章 亲和纯化技术 * 亲和纯化技术（Affinity purification）:利用生物分子间的特异性结合作用的原理进行生物物质分离纯化的技术 “亲和力” 亲和纯化技术 * 亲和层析(Affinity chromatography) 亲和过滤（膜分离） 亲和分配（双水相萃取） 亲和反胶团萃取（反胶团萃取） 亲和沉淀（沉淀） 亲和电泳（电泳） 第一节 亲和层析 (Affinity Chromatography) * 亲和层析 * 第一节 亲和层析(Affinity Chromatography) * （1）配基固定化：配基与载体偶联，结合成具有特异亲和性的分离介质。 （2）吸附样品：亲和层析介质选择性吸附生物活性物质. （3）样品解吸：选择适宜的条件使被吸附物活性物质解吸。 一、亲和层析的原理和特点 * * 利用生物大分子物质具有与某些相应的分子专一性可逆结合的特性而建立的层析技术。 适用于从成份复杂且杂质含量远大于目标物的混合物中提纯目标物。 经过一次处理可得到高纯度活性物质 ； 特异性强、分离效果好、分离条件温和； 亲和吸附剂通用性较差，专用的吸附剂。 亲和吸附剂：载体—配基 * 在亲和层析中起可逆结合的特异性物质称为配基（Ligand）。 与配基结合的层析介质称为载体（Matrix）。 配基-底物（Ligand-substance） 配基-底物：亲和对 * 特异性好 通用性差 * 梁山伯 朱丽叶 杨贵妃 小龙女 祝英台 林黛玉 崔莺莺 Ligand