蛋白质的修饰和表达分解.ppt

第三章 蛋白质的修饰和表达 蛋白质的修饰和表达是蛋白质工程的重要研究内容和手段。将从蛋白质修饰的化学途径、蛋白质改造的分子生物学途径和重组蛋白质的表达进行讲解。 第一节 蛋白质修饰的化学途径 蛋白质的化学修饰：凡通过活性基团的引入或去除，而使蛋白质的一级结构发生改变的过程。 有些情况下，化学结构的改变并不影响蛋白质的生物学活性，这些修饰称为非必需部分的修饰。但多数情况下，蛋白质结构的改变将导致生物活性的改变。 影响化学修饰的主要因素有两方面： 1、蛋白质功能基的活性反应，包括基团之间的氢键和静电作用等，基团之间的的空间阻力。 2、修饰剂的反应活性。 一、蛋白质侧链的化学修饰 在20种天然氨基酸的侧链中，大约有一半可以在足够温和的条件下产生化学取代而不使肽键受损，其中氨基、巯基和羧基特别容易产生有用的取代。 因为任何给定的氨基酸残基在蛋白质分子中可能出现不止一次，如果用化学的方法对氨基酸进行修饰时，正常情况下所有相关的氨基酸侧链都要被取代。至于谈到氨基和羧基基团，尽管处在侧链上和末端基团的pK值有差别，但在化学上很难将肽链的?-氨基或?-羧基基团与侧链上的氨基或羧基相区别。 蛋白质侧链的化学修饰是通过选择性试剂或亲和标记试剂与蛋白质分子侧链上特定的功能基团发生化学反应而实现的。 （一）巯基的化学修饰 由于巯基有很强的亲核性，巯基基团一般是蛋白质分子中最容易反应的侧链基团。 烷基化试剂是一种重要的巯基修饰试剂，特别是碘乙酸和碘乙酰胺。氨基酸测序前，常用碘乙酸来使巯基基团羧甲基化，以防止半胱氨酸的降解。 其他一些卤代酸、卤代酰胺也可以修饰巯基。 N-乙基马来酰亚胺也是一种有效的巯基修饰试剂，该反应具有较强的专一性并伴随光吸收的变化。 5，5-二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB）是目前最常用的巯基修饰试剂之一，可与巯基反应形成二硫键，使蛋白质分子上标记1个2-硝基-5-硫苯甲酸（TNB），同时释放一个有颜色的TNB阴离子，该离子在412nm有很强的吸收，可以通过光吸收变化来检测反应程度。 （二）氨基的化学修饰 赖氨酸的ε-氨基是蛋白质分子中亲核反应活性很高的基团，是蛋白质或多肽分子比较容易与修饰剂发生作用的位点。 常见的修饰剂有三硝基苯磺酸、烷基化试剂、氰酸盐以及盐酸吡哆醛等。 （三）羧基的化学修饰 谷氨酸、天冬氨酸 修饰方法很有限，产物一般是脂类或酰胺类。 （四）二硫键的化学修饰 一般用变性剂如巯基乙醇，将二硫键还原成游离的巯基，再通过巯基修饰的方法对其进行修饰，如经过羧甲基化处理，以防止重新氧化成二硫键。 （五）其他侧链基团的修饰 1、组氨酸残基的咪唑基可以通过氮原子的烷基化或碳原子的亲核取代来进行修饰。 2、酪氨酸残基的修饰既可以是酚羟基的修饰，也可以是芳香环上的取代反应。 3、精氨酸残基含一个胍基，精氨酸残基的强碱性，使其很难与大多数试剂发生修饰反应，但可以和二羰基化合物发生反应。 4、色氨酸吲哚基可以发生取代反应或者被氧化裂解。N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）可以使吲哚基团氧化成羟吲哚衍生物，但专一性较差，酪氨酸残基也可与该试剂发生反应。 5、蛋氨酸主要是由于硫醚的硫原子的亲核性所引起的，一些氧化剂可以使蛋氨酸氧化。 二、蛋白质的位点专一性修饰 专一性包括两方面的含义：一是试剂对被修饰基团的专一性；二是试剂对蛋白质分子中被修饰部位，如膜蛋白质上的激素结合部位、酶的活性部位等位点的专一性，一般这类试剂不仅具有对被作用基团的专一性，而且具有对被作用部位的专一性。这类专一性的化学修饰，称为亲和标记或专一性的不可逆抑制作用。这类修饰试剂也被称为位点专一性抑制剂。 （一）亲和标记 亲和标记是一类位点专一性的化学修饰，试剂可以专一性标记于酶的活性部位上，使酶不可逆的失活，因此又称为专一性的不可逆抑制作用。 这类抑制剂可分为两类： 一类是Ks型的不可逆抑制剂，它是根据底物的结构设计的，它具有和底物结构相似的结合集团，同时还具有和活性部位氨基酸残基的侧链基团反应的活性基团。 另一类是Kcat型的不可逆抑制剂，是根据酶催化过程设计的。这类抑制剂具有和底物类似的结构，具有被酶催化和结合的性质。此外还有一个潜伏反应基团，在酶对它进行催化反应时，这个潜伏基团被酶催化而活化，对活性部位起不可逆抑制作用。这类抑制剂的专一性很高，被称为“自杀性底物”。 （二）光亲和标记 这类试剂在结构上除了有一般亲和试剂的特点外，还具有一个光反应基团。 反应一般分两步进行：第一步，试剂先与蛋白质的活性部位在暗条件下发生特异性结合；第二步，光照，试剂被光激活后，产生一个高度活泼的功能基团，与活性部位的侧链基团发生反应。 三、蛋白质的聚乙二醇修饰 聚乙二醇（PEG）由环氧乙烷聚合而成，两端各有一个羟基，若一端以甲基封闭则得到单甲氧基聚乙二醇（mPEG