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3DbiopharmGD 上海思路迪生物技术有限公司 2011 ——慢病毒培训 学习纲要 什么实验会用到慢病毒 慢病毒是什么 慢病毒的包装流程 思路迪在慢病毒包装方面的优势 思路迪慢病毒服务体系 上海思路迪生物技术有限公司 * 什么实验会用到慢病毒-生物实验分类 上海思路迪生物技术有限公司 * 什么实验会用到慢病毒-干涉实验策略 干涉实验，现在多从基因水平和RNA水平进行干涉，在蛋白水平进行检测 上海思路迪生物技术有限公司 * Actin X-protein 什么实验会用到慢病毒-干涉方法遇到的问题 一般通过质粒转染将目的基因引入细胞，从而对目的蛋白进行干涉，并发明了很多辅助转染的试剂，其中Lipofectamine 2000最为常用，但仍然存在一部分难转染的细胞， eg: 原代细胞，悬浮细胞，神经细胞 上海思路迪生物技术有限公司 * 转染试剂 什么实验会用慢病毒-慢病毒的优势 慢病毒作为一种载体，可以将目的基因转入细胞，甚至整合到细胞的基因组中，很好的解决部分细胞难以转染的问题。 1，感染广谱性更强：可以感染80%以上种类的细胞 2，感染效率更高：细胞状态，特性 上海思路迪生物技术有限公司 * 脑胶质瘤细胞 悬浮细胞 慢病毒的结构 慢病毒是一种RNA病毒，因其潜伏期较长而被称为慢病毒。 上海思路迪生物技术有限公司 * 慢病毒感染细胞的过程 上海思路迪生物技术有限公司 * 慢病毒感染细胞的过程 慢病毒遗传信息 上海思路迪生物技术有限公司 * Gag：负责编码表达病毒结构蛋白 Pol：负责编码表达一些酶类蛋白 Env：负责编码表达病毒的膜蛋白 Rev ：通过作用于Rev响应元件(RRE, Rev-responsive element)负责将病毒mRNA转运出细胞核 慢病毒的载体改进 上海思路迪生物技术有限公司 * 第一代慢病毒载体 第二代慢病毒载体 第三代慢病毒载体 Gag-pol rev 5’LTR-ψ-外源基因-3’LTR VSV-G Gag-pol-rev-Vif-Vpr-Vpu-Nef-tat 5’LTR-ψ-外源基因-3’LTR VSV-G Gag-pol-rev 5’LTR-ψ-外源基因-3’LTR VSV-G 每一代的慢病毒载体改造都使慢病毒的载体更加安全，1，只有含有包装信号ψ的序列才能被包装入慢病毒的遗传信息，由于编码结构蛋白，酶类和膜蛋白的片段都不含有包装信息，所以他们变成了一次性的消耗品，在进入靶细胞后不能复制扩增；2，将一些对细胞有影响的毒性基因剔除；3，将不同的信息放在不同的载体中，降低重组几率 思路迪高安全性的四质粒包装体系 上海思路迪生物技术有限公司 * 思路迪采用第三代慢病毒包装体系，将Gag/Pol与Rev基因分为两个质粒载体表达，大大降低了病毒重组的概率，是目前最为安全的慢病毒载体包装体系。 cPPT：有助于入核 WPRE：有助于mRNA的稳定性 RSV驱动整个病毒相关结构的表达。 病毒包装流程 上海思路迪生物技术有限公司 * 注意事项： 1，细胞系的选择，容易转染，增殖快，易培养。 2，包装质粒与辅助质粒的纯度与比例 3，细胞状态的确定 5，根据目的感染细胞选择合适的包膜蛋白辅助质粒 细胞传代（293T） 质粒进入细胞（转染） 上清收集（病毒出芽后存在于细胞上清中） 过滤（去除细胞碎片等杂质） 高速离心（浓缩过程） 滴度测定 病毒滴度测定方法 病毒的滴度（TU/ml）：每毫升病毒液中含有的病毒数量。滴度值用于评估一定数量靶细胞所需要的病毒数我们的粗病毒液滴度在10^7浓缩后的病毒滴度可以达到5*10^8-10^9. 上海思路迪生物技术有限公司 * 细胞复苏 病毒感染 滴度测定 ELISA检测对病毒颗中的p24蛋白 qPCR检测病毒颗粒RNA qPCR检测整合到基因组中的病毒序列 FACS/荧光显微镜检测荧光蛋白表达量 不能区分病毒颗粒是否有活性 不能区分病毒颗粒是否有活性 已整合至基因组中，是有活性的病毒颗粒 能够表达目的蛋白，是有活性的病毒颗粒 由于测定的是病毒颗粒的蛋白，难以判断病毒颗粒是否完整并具有感染能力，所以测定的滴度偏高 同样难以判断病毒颗粒是否具有感染能力，测定的滴度偏高 不受外源插入片段的影响，不需要反转录步骤 载体上不一定都有荧光蛋白 ? ? 慢病毒载体体外感染流程 上海思路迪生物技术有限公司 * ? 瞬时感染所需病毒液的量（ml）＝MOI*N/慢病毒滴度 MOI（ Multiplicity of infection ）：用来转染单个细胞的病毒数量，即感染时病毒与细胞数量的比值。 N ：预转染的细胞数目 注：针对每种细胞都有不同的MOI值，一般为2-5，最好不要超过20，否则对细胞会有毒性作用（极少实