MALDI_TOF_MS技术及应用.pptx

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术田中耕一【日】约翰·贝内特·芬恩【美】2002年诺贝尔化学奖发展了对生物大分子进行鉴定和结构分析的方法，建立了软解析电离法对生物大分子进行质谱分析MALDI技术离子化技术：MALDIMatrix-Assisted Laser Desorption/ IonizationMALDI技术的原理样品与基质，在样品靶表面形成的共结晶薄膜激光照射，基质吸收能量基质把能量传递给样品分子，将电荷转移给样品，样品电离。质谱分析原理进样系统离子源质量分析器检测器1.单聚焦2.双聚焦3.飞行时间4.四极杆 1.气体扩散2.直接进样3.色谱1.电子轰击2.化学电离3.场致电离 4.激光 基质辅助激光解吸电离(MALDI)基本原理： 将样品分散在基质分子中并形成共结晶后直接进样, 当用激光(337 nm的氮激光或355 nm的固体激光器)照射晶体时, 基质吸收了激光的大部分能量，使基质分子和样品获得能量投射到气相并得到电离，成为带电荷的离子。因此基质在样品离子形成过程中起到了质子化或去质子化的作用，使样品分子带上正电荷或负电荷，成为带电荷的离子。离子源特点: 1、使用脉冲式激光； 2、产生单电荷离子和部分双单电荷离子，质谱图中的谱峰与样品各组分的质量数有一一对应关系； 3、离子化效率高，灵敏度高 (fmol～amol)常用基质： 芥子酸(3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸)（SA)、龙胆酸(2,5-二羟基苯甲酸)(DHB)、α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)、吡啶甲酸(PA)、3-羟基吡啶甲酸(3HPA)。MALDI技术中基质的作用把样品分子彼此分开(基质：样品=10，000：1)，削弱样品分子之间的相互作用。基质吸收激光的能量，并将部分能量传递给样品。帮助样品离子化。基质是如何帮助样品分子电离的？以正离子模式为例：? 基质吸收激光的紫外波长后增加能量，並将能量部分释放给样品分子? 帮助样品分子质子化，並帶有电荷（M+H+）? [M+H]+ 在真空状态下，雾化形成气态单一分子。在高压电场的吸引下[M+H]+ 离开离子源飞向飞行管Matrix - CHCA常用基质及选择基质样品HCCA蛋白，多肽，糖，小分子，极性聚合物DHB蛋白，多肽，糖，小分子，极性聚合物HPA核苷酸Dithranol非极性聚合物IAA非极性聚合物MALDI-TOF质谱的原理t = c · m/zE=U·z=1/2mv2 和 t=L/V E：离子在加速电场获得的动能; U：加速电场电压z：离子所带电荷;m：离子质量v：离子飞行速度;L：飞行管道长度t：离子飞行时间;c：常数 质量分析范围：500Da---100KDaTime1.3 MALDI-TOF-MS质谱的分析步骤1：基质与多肽样本共同置于刚靶上。多肽离子在TOF管里飞行，飞行速度取决于多肽离子的M/Z的大小 20 - 25 kVFlight tubeHigh vacuum4. 到达检测器的离子，通过检测器检测出每个肽段离子的M/Z.High voltage2. 样本被激光电离形成多肽离子混合物 。Pulsed laser5. 检测到每个离子的M/Z后，同一张图谱上计算机输出每个肽段M/Z，即蛋白质的多肽图谱，通过与理论数据库中的肽图片比对，从而鉴定蛋白。Analytemolecules in matrixMALDI-TOF-MS线性模式检测VacuumlockLaserVacuum systemIon detectorSampleplateAccelerationgridsDrift tubeMass spectrum几秒钟即可得到结果 MALDI-TOF 质谱的特点? 软电离质谱－碎片少? 检测质量范围宽400kDa? 灵敏度高－ fmol? 分析速度快－自动化? 数据容易解释? 可以测试混合物? 可以测试高分子? 仪器容易使用、维护variableattenuator lasertriggerdiode1.8 m linear3.4 m reflector250 l/sturbo250 l/sturboMALDI TOF MS的构成检测器1：线性模式检测器2：反射模式线性模式和反射模式反射模式（linear）一般测试分子量小于4000的样品分辨率高，单同位素清晰准确线性模式（reflection）一般测试大分子量样品（M4000）分辨率低，得到是平均分子量的质荷比反射模式下TOF的分辨率高于线性模式Bruker公司仪器示意图ABI公司仪器示意图岛津公司仪器示意图DetectorHelium collision cell for fragmentgenerationIon gate forparent ionselection20 KeVMALDI IonSo