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第三章 生物制品的制备P62NP80 细胞破碎 定义：细胞破碎是指选用物理、化学、酶或机械的方法来破坏细胞壁或细胞膜 目的：破坏细胞的外壳，使细胞内含物有效地释放出来，获得有效的提取。 细胞破碎是生物大分子初级分离纯化的第一步，也是一个重要环节，它直接影响了产物的加收率及纯度 一、机械破碎方法 通过机械运动所产生的剪切力的作用，使细胞破碎的方法称为机械破碎法。 二、物理破碎方法 通过各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法，统称为物理破碎方法。 物理破碎方法多用于微生物细胞的破碎。 三、化学破碎方法 化学破碎方法：通过化学试剂的作用，使细胞膜的结构改变或破坏，使细胞膜的透过性改变。 常用的化学试剂可分为有机溶剂和表面活性剂两大类。 十二烷基硫酸钠：SDS 四、酶学破碎方法 酶学破碎方法：利用溶解细胞壁的酶(外加的或细胞本身存在的酶)处理菌体细胞，使细胞壁受到破坏后，再利用渗透压、冲击等方法破坏细胞膜 分为：外加酶制剂和自溶法。 自溶作用 自溶作用是利用生物体自身产生的酶来溶胞，而不需外加其他的酶。 在微生物代谢过程中，大多数都能产生一种能水解细胞壁上聚合物的酶，以便生长过程继续下去。 自溶作用：改变其生长环境（温度、ｐＨ、缓冲液），可以诱发产生过剩的这种酶或激发产生其它的自溶酶，以达到自溶目的。 缺点：易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。 三、各种不同表达形式的产物 采用的分离纯化方法（P81，ＮＰ101） （一） 细胞内不溶性产物——包含体（或包涵体） 大肠杆菌表达系统的重组小分子目的蛋白，以不溶性形式产生并聚集形成蛋白质聚合物——包含体 以包含体形式存在的蛋白分子不具有正确的天然三维结构，表达蛋白不具有生物活性，因此在纯化过程中必须溶解包含体并对表达蛋白进行复性。 步骤：细胞收集与破碎、包含体的分离、洗涤与溶解、变性蛋白质的纯化、重组蛋白质的复性、天然蛋白质的分离 （二）分泌型的表达产物（P83，NP103） 分泌型的表达产物通常体积较大、浓度较低，必须在纯化以前进行浓缩 浓缩方法包括：沉淀、超滤 （三）细胞内可溶性表达产物 可获得高纯度、高活性的目的蛋白质 * * 一、生物制品原料的选择、预处理与保存方法 （1）原料选择 原料的选择原则： ①有效成分含量高，新鲜； ②原料来源丰富，产地较近； ③原料中杂质含量少； ④原料成本低等。 第一节 一般生物制品的制备方法 ①植物原料生长的季节性； ②微生物原料的对数期； ③动物原料的年龄与性别。 原料的选择注意事项： ①动物原料：采集后要立即处理，去除结缔组织、脂肪组织等，并迅速冷冻贮存。 ②植物原料：要择时采集并就地去除不用的部分，保鲜处理； ③微生物原料：要及时将菌细胞与培养液分开，进行保鲜处理。 （2）原料的预处理： ①冷冻法。该方法适用于所有生物原料。常用-40℃速冻。 ②有机溶剂脱水法。常用的有机溶剂是丙酮。该法适用于原料少而价值高、有机溶剂对活性物质没有破坏作用的原料，如脑垂体等。 ③防腐剂保鲜。常用乙醇、苯酚等。该法适用于液体原料，如发酵液、提取液等。 原料的保存方法： 生物组织与细胞的破碎：生物制品大部分存在于生物组织或细胞中，要提高提取率，破碎过程是非常重要的。 二、生物制品的提取 动物细胞: 多分泌到细胞外培养液 植物细胞: 多为胞内产物 微生物（细菌/真菌）: 胞内、胞外 对于胞内产物需要进行细胞破碎。　 不同类型的细胞分泌目标产物的类型： 胞外：大多数情况下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目标产物存在于发酵液中。 胞内：有些目标产物存在于生物体中。 尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质是在细胞内沉积。 脂类物质和一些抗生素包含在生物体中。 细胞破碎方法 细胞破碎方法 机械破碎法 物理破碎法 化学破碎法 酶学破碎法 常用的仪器 高速组织捣碎机 匀浆器 研磨器 物理破碎法的分类 物理破碎法 温度差破碎法 压力差破碎法 超声波破碎法 （2）提取（extraction） 生物组织与细胞破碎后要立即进行提取。提取时，首先要根据活性物质的性质， ①选择提取试剂。提取试剂主要有：水、缓冲溶液、盐溶液、乙醇、其他有机溶剂（如氯仿、丙酮等）。 ②考虑提取溶剂的用量及提取次数、提取时间。 ③注意提取的温度、pH、变性剂等因素。 包括蛋白质、多肽和酶类等药物。分离纯化方法有： 1.沉淀法：蛋白质、酶的初步纯化往往用沉淀法。原理是使蛋