第三章-生物制品的制备分解.ppt

2.细胞破碎与固液分离 （ 1 ）细胞收集 常用离心分离的方法；膜过滤法也逐渐得到广泛应用。 （ 2 ）细胞破碎 有机械破碎法和非机械破碎法。 （ 3 ）固液分离 分离细胞碎片是比较困难的，可以用离心、膜过滤或双水相分配的方法，使细胞碎片分配在一相（通常为下相）而分离，同时也起部分纯化作用。 3.目的产物的分离纯化 分离纯化主要依赖色谱分离方法。色谱技术是下游精制阶段的常用手段，该法优点是具有多种多样的分离机制，设备简单，便于自动化控制和分离过程中无发热等有害效应。色谱技术分为离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱、亲和色谱、凝胶过滤色谱、高压液相色谱等。 第二节 各类生物制品的分离纯化方法 蛋白质 核酸 糖类 脂类 氨基酸 2）亲和层析有如下特点（Characteristics of Affinity Chromatography） 纯化过程简单、迅速； 分离效率高； 产物纯度高； 必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻求稳定的层析条件。 因此应用范围受到一定的限制。 8）载体、配基、目的物的连接（Conjunction of vector、ligand and target material） 载体（Vectors or Matrix） + 配基（Ligand） + 目的物（target material） Fig AC relies upon a reversible highly  specific binding reaction. Fig Spacer arm principle Fig Principle of preparing AC media 9）亲和层析的基本操作方法： ①平衡（ Equilibration） 用平衡Buffer冲洗柱体，至基线平稳. 发酵液 细胞分离 胞内产物 胞外产物 细胞破碎 固液分离 包涵体 细胞碎片分离 变性 复性 浓缩 初步分离 高度纯化 制剂 产品 图3-8 基因工程制品分离纯化的一般流程 三、分离纯化的技术（technique of isolation and depuration） 分离纯化技术应满足下列要求： ①技术条件要温和，能保持目的产物的生物活性； ②选择性要好，达到较高纯化倍数； ③收率要高； ④要能直接衔接，不需要对物料加以处理或调整； ⑤整个分离纯化过程要快，能够满足高生产率的要求。 1、细胞破碎与固液分离（ cell crashing and solid and liquid isolation ） 以大肠杆菌为宿主药物多为胞内产物，分离需经细胞收集、细胞破碎和细胞碎片分离等步骤。 （1）细胞收集（cell collection）：常用离心分离，膜过滤法 （2）细胞破碎 （cell crashing） ：细胞破碎方法有机械破碎法和非机械破碎法。 机械破碎法速度快，处理量较大，不会带入其它化学物质；但要产生热量，要采取冷却措施，防止失活。 现常用方法有：高压匀浆法、超声波破碎法、高速珠磨法、高压挤压法。 高压匀浆器，利用高速造成的剪切、碰撞以及高压到常压的变化，使细胞破碎。 超声波破碎法是小量细胞破碎普遍使用的方法，用声频高于15～20KHz，其破碎机制可能与空化引起的冲击波和剪切力有关。 高速珠磨法设备是珠磨机，原理是细胞悬液与极细的玻璃小球、瓷球、石英砂等研磨剂快速搅拌研磨，利用珠子之间以及珠子和细胞之间的互相剪切、碰撞，促使细胞壁破裂，释放出内含物。 X-Press挤压机，把浓缩的细胞悬液冷却至-25～-30℃，形成冰晶，用500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀孔中挤出，冰晶体磨损和包埋在冰中的细胞变形引起细胞破碎。其优点是细胞碎片粉碎程度低，生物活性保持较好。 非机械破碎法包括酶溶法、化学渗透法、热处理法、渗透压冲击法等。 酶溶法就是利用生物酶将细胞壁和细胞膜溶解的方法。常用的酶有溶菌酶、葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽链内切酶、壳多糖酶等。酶溶法必须选择合适的酶，控制好温度、pH和酶用量。 化学渗透法得用一些有机溶剂（苯、甲苯）、抗生素、表面活性剂（SDS、Triton）、金属螯合剂（EDTA）、变性剂（脲、盐酸胍）等。 （3）固液分离 （solid and liquid isolation） 分离细胞碎片是比较困难的，可以用离心、膜过滤或双水相分配