第四章高效毛细管电泳解读.ppt

1.毛细管电泳的发展 1807～1809年，俄国物理学家F.F.Reuss首次发现黏土颗粒的电迁移现象。 1907年，Field和Teague首次用电泳成功分离了白喉毒素和它的抗体。 1937年，瑞典科学家将人血清提取的蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端加电压，第一次分离出白蛋白和?、?、?-球蛋白。 Tiselius还制成了第一台电泳仪并进行了第一次自由溶液电泳。他因对电泳技术的发展和应用的巨大贡献而获得1948年诺贝尔化学奖。 自由溶液电泳的分离效率受焦耳热的限制，只能在低电场强度下进行操作，使分析时间和分离效率很低。 1967年，Hjerten最早提出了用小内径管在高电场下进行自由溶液的电泳。 1981年，Jorgenson和Luckas发表了划时代的研究工作，用75um内径石英毛细管进行电泳，电迁移进样，荧光柱上检测丹酰化氨基酸，达到400000块/m理论塔板数的高效率。从此跨入高效毛细管电泳的时代。 2. 概况 电泳（electrophoresis）是电解质中带电粒子在电场作用下向相反方向迁移的现象，利用此现象对物质进行分离分析的方法，称为电泳法。 毛细管电泳（capillary elecrophoresis, CE）是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离分析的液相分离方法。 经典电泳法的局限性：难以克服由两端高电压引起的电解质离子流的自热，自热影响随电场强度额增大而迅速加剧，因而限制了高压的使用。 毛细管电泳：散热在效率很高的毛细管内进行，可以应用高电压，极大改善分离效果。 作用原理：电泳原理和色谱原理 带电粒子在一定介质中因电场作用而产生定向运动，因带电粒子所带的电荷数、带电粒子形状、解离度等不同，带电粒子在电解质中迁移速度不同而分离。------差速迁移过程。 特点：和HPLC 相比，都属于液相分离技术。 但是： 柱效高，可达105～106/m 分离速度快，几十秒～几十分钟 溶剂和试样消耗极少 没有高压泵，仪器成本比HPLC更低 选择性强 3. 毛细管电泳基础理论 3.1 电泳：在电场作用下带电粒子在缓冲溶液中的定向移动。 3.2 电渗：液体相对于带电的管壁移动的现象。 石英的等电点约为1.5，在常用缓冲溶液中(pH2)，管壁带负电。 在毛细管电泳中，同时存在着电泳流和电渗流，粒子在毛细管内的运动速度是这两种速度的矢量和： 组 分 表观淌度 表观迁移速度 正离子 ?ef + ?os uef + uos 中性分子 ?os uos 负离子 ?os - ?ef uos - uef 谱带展宽：柱内溶液和溶质本身：自热、扩散、吸附 来源于系统：进样和检测 3.3 引起谱带展宽的因素 产生的原因： 毛细管直径大； 内部的自热过大； 液体和固体表面接触处的摩擦力导致压力过低。 1. 流型 扁平型塞子流模型 抛物面动力学模型 2. 自热 电流通过缓冲溶液时产生的焦耳热 自热导致径向温度梯度，因而产生离子迁移速度的径向不均匀分布，使谱带展宽， 塔板高度增加，分离效率降低。 管内径小，管外径大，可减小自热引起的温度差 如：内径50um，外径375um 3. 扩散和吸附 扩散：在毛细管电泳中，溶质纵向扩散是谱带展宽的唯一因素 吸附：毛细管管壁对于被分离物质粒子的作用 阳离子溶质和带负电的管壁的离子相互作用 疏水作用 毛细管内表面积和体积比越大，吸附的可能性也越大 4.CE的分离模式 1. 毛细管区带电泳(capilary zone electrophoresis,CZE) CZE的分离机理是基于各被分离物质的净电荷与质量比(荷质比)间的差异。应用范围包括氨基酸、肽、蛋白、离子分析、对映体拆分和很多其它离子态物质的分析。 2 胶束电动色谱 (micellar electro kinetic capillary chromatography，MECC) MECC是唯一既能分离中性溶质又能分离带电组分的CE模式。采用表面活性剂(如十二烷基硫酸钠，SDS)在操作缓冲液内形成有一疏水内核、外部带负电的胶束相。利用溶质具有不同的疏水性，在水相和胶束相(准固定相)间分配的差异得以分离。主要用于小分子、中性化合物，手性对映体、各种药物等。 3.毛细管凝胶电泳(capillary gel electrophoresis，CGE) CGE是将凝胶移到毛细管中作支持物进行的电泳。不同体积的溶质分子在起“分子筛”作用的凝胶中电泳分离。常用于蛋白质、寡聚核苷酸、RNA、DNA片断分离和测序及PCR产物分析